SNT 1699.1-2006猪流行性腹泻微量血清中和试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1699. 1-2006猪流行性腹泻微量血清中和试验操作规程Protocol of micro-serum neutralization test for porcine epidemic diarrhea2006-01-26 发布2006-08-16 实施0中华人民共和国发布清 1胰荐 盘沟真饮国家质量监督检验检疫总局，数码防伪， SN/T 1699.1-2006前 言SN/T1699分为三部分：猪流行性腹泻微量血清中和试验操作规程；猪流行性腹泻病毒直接免疫荧光试验操作规程；猪流行性腹泻间接斑点酶联免疫吸附试验操作规程。本部分为SN/T1699的第1部分。本部分参照国际动物卫生组织(OIE)的标准《诊断方法和疫苗标准手册》,2004年第五版，并参考中华人民共和国进出境动物检疫规程手册制定。本部分的附录 A为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本部分起草人：罗长保、林志雄、朱道中、颜思通。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1699.1—2006猪流行性腹泻微量血清中和试验操作规程1范围SN/T1699的本部分规定了猪流行性腹泻微量血清中和试验操作技术要求。本部分适用于猪流行性腹泻微量血清中和抗体检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过SN/T1699的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法3设备和材料3.12猪流行性腹泻病毒株：已适应于传代细胞生长的猪流行性腹泻病毒 PEDV-G1毒株。3.2猪流行性腹泻阳性对照血清。3.3#猪流行性腹泻阴性对照血清。3.4:细胞：PK-15传代细胞。3.596孔微量细胞培养板。3.6微量移液器。3.7被检血清。3.8细胞培养液(Eargles MEM)3.9本标准所用水应符合GB/T6682中二级水的规格。4操作方法4. 1 病毒增殖在 PK-15细胞形成单层后倒掉培养液,将病毒液接种到单层细胞上，摇匀后置 37℃5%二氧化碳培养箱吸附 1h，吸附期间摇匀-一次，然后加人含 5%特牛血清细胞培养液(EarglesMEM)。每天观察细胞病(CPE),CPE达到75%～95%时收获。反复冻融三次后分装,置一70℃保存,待测定毒价后使用。4.2毒价测定在96孔微量板每孔加人50μL培养液，将上述病毒液用培养液按10倍递减法在另外的容器内稀释成 10-1～10-8个稀释度。用移液器将每一稀释度的病毒液分别移入 8 个孔内,每孔 50 μL。将培养好的PK-15细胞制备成20×104/mL～30×104/mL的悬液，在每个试验孔内加100μL，每孔总量为200μL。另设不加病毒液的8个细胞孔作为对照，用50uL培养液代替病毒液。置37℃5%二氧化碳培养箱中培养 72 h,每天观察 CPE,72 h判定结果。价测定：用Karber氏方法测定50%细胞病变滴度（TCIDso），见附录 A。4.3血清处理置56℃水浴箱内灭活30min。1 SN/T 1699.1—20064.4中和试验4.4.1稀释液用 Eargles MEM 作为血清和病毒的稀释液,各试验孔内加人 50 μL稀释液。4.4.2血清稀释将被检血清从1：4稀释至1：64,每个稀释度作3孔，每孔加各稀释度血清50μL,第一孔作为血清毒性对照，第二、三孔为正式实验孔。病回归试验和其他各项对照可用另一块微量板操作。4.4.3加病毒液将稀释好每 50μL中100TCIDs的病毒液按每孔50:L加到血清毒性对照孔之外的各孔内，振荡均勾。血清毒性对照孔加人 50μL培养液代替病蠢液,置 37℃5%二氧化碳培养箱内中和 1 h。4.4.4加细胞液将稀释成20×10*/mL～30×10*/mL的PK-15细胞悬液，按每孔-100μL加人中和完毕的各试验孔内，置37℃5%二氧化碳培养箱培养48h～72hz每天观察CPE，一般在72h终判。4.4.5对照对照孔的有关操作可按试验孔的有操作进行。细胞对照：4孔～8孔，每孔含稀释液100uL,细胞悬液100μL。阴性血清对照：4孔～~8孔,每孔病毒液50uL，细胞悬液100μL。阳性血清对照：4孔8孔,每孔病毒液50uL,细胞悬液100uL4. 5 病毒回归试验将工作病毒稀释成 01 个 TCIDsa、1 个 TCIDs。、10 个 TCID5o、100 个iTCIDsc四个稀释度。每个稀释度8个孔，毒价判定方法操作，对照的判读时间同试验