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细胞生物学研究方法考点 ●显微成像技术 ●光学显微镜 ●相差显微镜：用于观察无色、透明、活细胞中的结构 ●微分干涉相差显微镜：原理与相差显微镜相似，但更为灵敏 ●暗场显微镜：用于观察未经染色的活体或胶体粒子 ●放射自显影技术：若被检物以痕迹量存在，则可通过此技术扩大反差，使更容 易分辨其存在及定位 ●荧光显微镜 ● 用途：利用荧光研究细胞内物质的吸收和运输，以及化学物质的分布和定位 ●荧光抗体：连接了荧光染料的抗体 ●原理：为测定某个特定蛋白质在细胞内的定位，蛋白质只需用荧光抗体简单染 色后就能用适当波长的光对细胞进行观察 ●缺陷 ●荧光由于来自细胞的不同位置和层次，使成像不够清晰 ●为观察较厚的标本，需要在不同深度收集影像，在进行排列 ●绿色荧光蛋白 ●包含β折叠和α螺旋 ●被广泛用于报告分子 ●荧光共振能量转移技术 ●是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移技术 ● 用于检测体内两种蛋白质之间的直接相互作用 ● 用于检测细胞内Ca2+浓度的变化 ●共聚焦显微镜 ●有效解决荧光显微镜的问题 ● 能够直接获得高分辨率的三维图像 ● 电子显微镜（用电子束代替光波，从而提高分辨率） ●投射电子显微镜 ●扫描电子显微镜 ● 间接成像技术 ●扫描隧道显微镜(STM) ● 高分辨率 ●可直接探测标本表面结构，也可绘出立体三维结构图像 ●可在真空、常压、空气甚至溶液中探测物质 ●扫描速度快、成像速度快 ●体积小，方便携带 ●原子力显微镜：较STM 能够检测不导电的标本的图像 ●X 射线衍射：通过结晶标本形成的衍射样式成像 ●细胞分离、培养与融合技术 ●细胞分离 ●细胞分散悬浮：利用蛋白水解酶获得细胞悬浮液 ● 离心分离 ●原理：不同的细胞、细胞器和分子大小不同，可在不同离心力的作用下沉降 分解 ●差速离心法：根据被分离物质的体积差异 ●等密度离心法：根据被分离物质的密度差异 ●流式细胞术 ●性质：更为精密的分离技术 ● 目的：利用标记技术，从复杂的细胞混合物中分离某种特异细胞 ●细胞培养 ●基本概念 ●分为细胞培养、组织培养和器官培养 ●原代培养：直接从机体取出细胞、组织或器官后立即进行培养 ●细胞系：原代培养物经过首次传代成功后即为细胞系 ●体外细胞培养的条件 ●营养 ●生存环境 ●废物的排除 ●细胞融合 ●基本过程 ●①细胞融合形成异核体 ●②异核体进行核融合 ●③形成单核杂种细胞 ●单克隆抗体技术 ●B 淋巴细胞能产生抗体，但在体外不能无限分裂 ●瘤细胞能在体外无限分裂，但不能产生抗体 ●该技术即利用细胞融合技术获得单克隆抗体 ●蛋白质的分离与纯化 ●层析技术 ●凝胶过滤层析：根据蛋白质的质量进行分离 ●亲和层析：根据蛋白质的亲和力进行分离 ● 离子交换层析：根据蛋白质的电荷差异进行分离 ● 电泳技术 ●SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：完全根据蛋白质的质量大小进行分离 ●双向电泳：通过等电聚焦和SDS同时进行电泳 ●分子生物学方法 ●基因工程技术 ●DNA 分离：原理即电泳 ●DNA 扩增（PCR ）：原理为DNA 的半保留复制 ●DNA 酶切：利用限制性核酸内切酶 ●DNA 链接：利用DNA 连接酶 ●基因功能研究技术 ●基因敲除技术 ●含义：完全剔除一个有功能的