三七总皂甙对胎鼠皮层神经干细胞增殖分化、自我更新及bdnf、bfgf表达的影响.docxVIP

三七总皂甙对胎鼠皮层神经干细胞增殖分化、自我更新及bdnf、bfgf表达的影响 老鼠脑的许多脑区域都有神经干（nsc），它们被激活并最终分为神经和皮质细胞。成年脑内仍保留的神经干细胞则主要位于侧脑室室管膜下层(SVZ,subependymal ventrical zone)和海马齿状回颗粒细胞下层(subgranular zone ,SGZ),它们相对静止或增殖缓慢。以往实验从胎鼠纹状体、海马、皮层成功分离了神经干细胞,它们在营养因子bFGF或EGF作用下增殖并分化成神经元和胶质细胞,因此可用胎鼠神经干细胞进行离体实验。本实验拟选取17d胎鼠皮层神经干细胞,通过细胞培养及免疫细胞化学技术测定它们的增殖 和分化以及三七总皂甙对其的影响,进一步阐明三七总皂甙的作用机理。免疫细胞化学选取抗体Nestin标记神经干细胞或神经前体细胞、PCNA检测神经干细胞或神经前体的增殖、Tuj-1和NF检测未成熟和成熟神经元、Vimentin和GFAP检测未成熟和成熟胶质细胞,同时检测神经营养因子bFGF和BDNF的表达。 1 材料和方法 1.1 实验动物 已妊娠17d的Wistar雌性大鼠,由协和医科大学动物所提供。 1.2 细胞培养试剂 DMEM/F12(Gibco)、B27(Gibco)、胎牛血清(Sigma)。 1.3 无血清基础培养液组dmem/fps 在超净工作台上,严格无菌操作下取E17的 Wistar大鼠皮层组织,剥离脑膜,解剖液清洗血污后,在DMEM/F12(体积比1∶1)剪成1mm3碎块,加入0.125%胰蛋白酶溶液,37℃消化25 min,其间轻摇2次,加入10%胎牛血清终止消化,用DMEM/F12洗去血清,吸管机械性反复吹打后制成单细胞悬液,经胎盘蓝计数活性细胞。用含B27和DMEM/F12的无血清基础培养液调整细胞含量为2×105mL-1,将细胞悬液分装于涂有多聚赖氨酸的25 ml细胞培养瓶(每瓶5 ml)和加盖玻片的12孔培养板(每孔1 ml),分为对照组和给药组,其中对照组为含B27和DMEM/F12的无血清基础培养液,给药组在对照组培养条件基础上加入三七总皂甙(100ug/mL)。对照组和给药组置于37℃、体积分数为5%的C O2细胞培养箱进行培养。 1.4 p2p细胞传代增殖观察 为研究三七总皂甙对NSCs增殖和自我更新的作用,将原代培养7d的细胞进行细胞传代和单细胞克隆。 原代细胞经细胞培养7d后传代,细胞含量2×104mL-1,称为P1细胞,P1细胞培养7d后再传代,细胞含量2×104mL-1,称为P2细胞。原代细胞进行传代的同时,另进行细胞单细胞克隆,即将原代细胞悬液经培养液稀释,进行细胞计数至稀释到每mL含活细胞数为1-2个后,将细胞悬液加入96孔细胞培养板,每孔100μL,记录只含1个细胞的孔进行观察。以上P1细胞、P2细胞及单细胞克隆的分组和培养液条件同原代细胞,不同的是培养瓶和培养板不涂多聚赖氨酸,而使其悬浮生长。 1.5 u3000spb的制作 将培养板培养的对照组、给药组原代细胞于培养第4d,分别进行免疫细胞化学反应,以观察两组原代细胞培养4d时Nestin的表达、增殖以及分化为神经元和胶质细胞的情况,并观察营养因子bFGF、BDNF的表达。 具体方法采用ABC法:(1)用吸管吸出培养板孔中的培养液,0.01MPBS(PH=7.2)冲洗3遍;(2)4%多聚甲醛/0.1MPB(pH7.2-7.4)固定20 min,0.01MPBS冲洗3遍,每次5 min;(3)1% H2O2(甲醇配置),室温15min,0.01MPBS冲洗3遍,每次5 min;(4)10%正常羊血清封闭,室温20min;(4)一抗孵育, 4℃过夜;(5))S-A/HRP工作液(ZYMED)37℃2小时,0.01MPBS洗3次,每次5分钟;(6)0.05%DAB-0.01% H2O2液显色,脱水封片。阴性对照片省去一抗,用0.01MPBS代替。一抗分别为小鼠抗Nestin(1:500,Pharmingen)、小鼠抗PCNA(1:80,ZYMED)、兔抗Tuj-1(1:1000, RD)、小鼠抗NF(1:80,Santa Cruz)、小鼠抗Vimentin(工作液,Sigma)、 兔抗GFAP(1:500,ZYMED)、兔抗bFGF(1:800,Santa Cruz)、兔抗BDNF(1:80,Santa Cruz)一抗稀释用0.01 M PBS; 1.6 免疫阳性细胞检测 采用CMIAS真彩图像分析系统(北京航空航天大学生产)对Nestin、PCNA、Tuj-1、NF、Vimentin GFAP免疫阳性细胞进行测量分析,每组随机取3张切片,每张切片随机取3个视野,记录每个统计场的阳性个数,用平均阳性细胞个数(xˉ±s)(xˉ±s)表