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有氧运动对氨基酸类神经免疫活性的影响 氨基乙酸钠（glu）-是中枢神经系统中的一个重要的刺激性和抑制性神经流激物。大量神经解剖学研究证实,Glu能神经和GABA能神经广泛分布于心血管自主神经调节环路中,是调节机体循环、呼吸和内分泌功能的重要结构基础。 长期有规律的运动训练可使心血管自主神经平衡状态发生改变,总体表现为安静状态的心交感神经张力下降,心迷走神经张力升高,但是,这种改变的中枢机制不清。目前,尚缺乏心血管自主神经中枢内各神经核团对长期运动应激产生应答反应方面的相关研究报道,尤其是针对长期运动训练调节自主神经中枢各神经核团内Glu能神经和GABA能神经的研究更少,仅见于美国Jeffery M Kramer所在课题组以自发性高血压大鼠为研究对象的一项研究。 基于此,本研究以正常雄性SD大鼠为研究对象,随机分为8周中等强度游泳运动组和安静对照组。应用免疫组织化学技术观察自主神经中枢各神经核团(下丘脑室旁核、孤束核、疑核、延髓头端腹外侧核、延髓尾端腹外侧核、胸3脊髓灰质中间外侧柱)内Glu和GABA阳性产物的表达情况,以氨基酸自动分析仪检测脑脊液中氨基酸类神经递质含量。通过比较运动组和对照组大鼠上述指标的差异,分析长期参加有氧运动对心血管自主神经中枢的影响,探讨自主神经平衡状态发生改变的中枢机制。 1 试验对象和方法 1.1 动物、饲料与饲养 健康雄性Sprague-Dawley大鼠30只,两月龄,体重183～214 g。动物合格证号0050484,动物级别SPF/VAF(北京维通利华实验动物技术有限公司)。分笼饲养,每笼5只;国家标准鼠类干燥饲料喂养,自由进食进水;自然昼夜节律光照,动物室内温度22℃～29℃,相对湿度55%～65%。 1.2 实验方法 1.2.1 运动及游泳训练 大鼠在动物房适应性饲养3天后,按体重排序进行编号,随机分为8周有氧运动组(简称运动组)和安静对照(简称对照组)(表1)。 对照组:正常笼内生活,不施加运动干预。在运动组每日训练的同时,对照组大鼠下水浸湿后即捞出,吹干。 运动组:游泳池水面面积1.13 m2,水深60 cm,水温33℃±2℃,每个游泳池分配5只大鼠。游泳训练共持续8周,每周训练6天,休息1天。训练分3个阶段进行:1)第1周为适应性训练,每天逐渐增加游泳时间,使第1周末游泳时间达到1 h,第2～3周每天游泳1 h;2)第4～5周每天游泳1.5 h;3)第6～8周每天游泳2 h。 1.2.2 gaba包膜分析 1.2.2. pbs的制作 为避免急性运动的影响,在末次训练结束后24 h取材,运动组和对照组交替进行。大鼠用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉,于胸骨剑突处开胸,左心室插管至升主动脉,用300 ml生理盐水(37℃左右)快速冲洗,直至流出液体变清为止。继之灌入4%多聚甲醛(0.1 mol/L的PBS配制,pH7.4)500 ml,先快后慢(灌流时间在30～45 min)。灌注结束后立即取脑和脊髓,分离出下丘脑前部(视交叉和灰结节之间)、延髓、脊髓T3节段,置于4%多聚甲醛PBS溶液中,4℃后固定2 h,然后移入20%蔗糖PBS溶液(pH7.2～7.4)中,4℃保存过夜,至组织下沉。冰冻切片机在-20℃(恒温)条件下进行冠状切片,每隔3张取1张,切片厚度为30 μm,依次分成3套,1～2套分别进行Glu和GABA的SABC免疫组化染色,第3套做免疫组化对照实验。 1.2.2. 高效液相色谱法glu、gaba 1. 切片用30%过氧化氢孵育10 min,消除内源性过氧化物酶的活性,PBS洗涤3次。 2.滴加试剂A(5%正常山羊血清,PBS稀释)封闭,室温孵育15 min,倾去血清,勿洗。 3. 每套切片分别滴加1∶100稀释的一抗(Glu、GABA),37℃孵育2 h,PBS冲洗3次。 4.滴加试剂B(生物素化二抗工作液,即生物素标记的山羊抗兔IgG),37℃孵育15 min,PBS冲洗3次。 5.滴加试剂C(辣根酶标记链霉卵白素工作液),37℃孵育15 min,PBS冲洗3次。 6.DAB呈色:取1 ml双蒸水,加入DAB试剂盒中的试剂A一滴,混合均匀后将试剂B和试剂C各一滴加入其中,再次混匀(现用现配,避光保存,30 min内使用)。将混均的显色液加至切片上,室温显色,显色时间为30 min。缓冲液中止显色,蒸馏水充分冲洗。 7.苏木素轻度复染。梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。 8.阴性对照切片以PBS代替第一抗体进行孵育(步骤3),其他同上述步骤。对照切片未发现阳性产物即无特异性反应。 1.2.2. 半定量分析方法 采用Q550CW型(德国Leica)图像分析系统,参照王平宇《大鼠脑读片提要及图谱》对下丘脑室旁核(PVN)、孤素核(TNS)、疑核(NA)、延髓