芍药苷对体外白色念珠菌生物膜的抑制作用.docxVIP

芍药苷对体外白色念珠菌生物膜的抑制作用 不同质量浓度两社会糖苷对白色真菌细胞黏附的抑制作用 本实验的创新观察表明，芍药对于白净菌的生物膜的抑制作用，不同质量浓度的芍药对白色细菌的细胞粘附具有抑制作用，白色细菌的生物膜也有抑制作用，抑制率与药物的质量浓度呈正相关。 0 细菌耐药性增加 白色念珠菌是口腔的正常菌群之一, 在正常情况下其与口腔中的其他正常微生物一起维持口腔中的生态平衡, 当大量应用抗生素控制细菌繁殖时, 对抗生素不敏感的白色念珠菌乘机大量生长, 破坏口腔微生态系平衡, 进而出现菌群失调, 导致口腔白色念珠菌生物膜相关感染频繁出现, 患者真菌感染发病率明显增高, 各大医药厂商不断推出新的抗真菌药物, 这样一来产生的不利影响是耐药性菌株不断地被筛选, 耐药性菌株大量增加。由于唑类抗真菌药如氟康唑与伊曲康唑等临床效果较好, 成为医生的首选药物, 而广泛应用是耐药性菌株大量增加另一个重要原因。附着在根管内壁的生物膜被称之为根管生物膜, 是根尖周炎的主要致病因素。有文献报道称白色念珠菌作为感染根管内真菌的主要组成部分, 被认为是导致根管治疗失败的原因之一, 以生物膜形式存在的微生物可降低抗菌药物的敏感性, 甚至产生耐药性, 这也是临床上与生物膜形成相关感染性疾病难以治疗的原因之一。近年来, 随着广谱抗生素及免疫制剂广泛应用, 耐药菌株逐年上升, 真菌感染呈明显上升趋势, 并伴随并发症的发生。传统中药具有作用持久, 毒性小等特点, 所以从天然药物中即中药中开发利用新的根管抗菌药物具有非常广阔的前景, 因此从中药中寻找抗白色念珠菌生物膜的新药无疑是一个新的选择。以往研究报道中药赤芍有效成分对白色念珠菌有较好的抑制作用, 但其单体芍药苷白色念珠菌生物膜是否有抑制作用未见报道。实验观察芍药苷对白色念珠菌生物膜的抑菌作用, 探讨其在口腔生态失调中的意义, 为芍药苷治疗白色念珠菌引起的难治性根管感染和根尖周炎提供新途径。 1 菌株制备和培养 对比观察实验。 白色念珠菌ATCC90028, 购自中国医学科学院微生物研究所;芍药苷 (国药试剂产品编号SM212806) ;醋酸洗必泰 (锦州九泰制药有限公司) 。 MTT DMSO PI FDA (Sigma公司) ;YPD液体培养基 (蛋白胨20 g/L) , (酵母提取物10 g/L) , (葡萄糖20 g/L) 、沙堡琼脂培养基 (蛋白胨10 g/L) , (葡萄糖40 g/L) 、 (琼脂20 g/L) 、RPMI-1640 (GIBICO公司) ;胎牛血清 (杭州四季青公司) 。 Multiskan MK3全自动多功能酶标仪 (Thermo Scientific, 美国) ;激光共聚焦显微镜 (U-TB190型日本Olympus公司) 。 ①MTT溶液制备:用0.22μm的滤器以p H7.2的PBS配制5 g/L的MTT, 过滤除菌分装后避光保存于4℃冰箱中。②白色念珠菌菌液的制备:将冻存的标准白色念珠菌菌株进行复苏, 并立刻接种到沙堡琼脂培养基上, 37℃恒温培养箱中培养48 h。在无菌超净工作台上将单菌落接种在YPD液体培养基中, 37℃恒温培养箱过夜培养12 h, 将冻存的菌株解冻接种于沙氏培养, 收集菌体后以p H 7.2的PBS冲洗3遍, 血细胞计数板计数后, 以RPMI-1640培养液稀释, 将菌悬液浓度调整为1×109L-1。标准菌悬液制备好之后立即应用到实验中。 体外抑菌活性测定 实验共分4组, 实验组、洗必泰组、阴性对照组与空白对照组。实验组芍药苷经DMSO (3%) 助溶后, 用RPMI-1640分别按2倍稀释法制备5个浓度梯度:4, 2, 1, 0.5, 0.25 g/L, 观察芍药苷对白色念珠菌的抑制。洗必泰组将母液用RPMI-1640稀释成5个浓度梯度:2%, 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125%, 观察洗必泰对白色念珠菌的抑制。阴性对照组观察RPMI-1640对白色念珠菌的抑制。空白对照组仅加入RPMI-1640培养液, 无白色念珠菌。 ①加菌液:利用微量加样器将1×109L-1的标准菌液100μL分别加入沙堡琼脂培养基中。②菌液定植:用20 cm的无菌玻璃棒涂匀, 37℃恒温培养箱培养1 h。③打孔封底:以1 m L规格的TIP头在沙堡琼脂培养基上打5孔, 利用琼脂封底, 室温等待琼脂凝固。④加药培养:用微量加样器取出不同梯度浓度药液各100μL分别加入各小孔中, 放入37℃恒温培养箱中培养24 h。⑤测量:不同浓度药物对白色念珠菌产生的抑菌环直径利用游标卡尺在深色背景下测量, 为取平均值每孔测量3次。⑥结果计算:平行实验10组, 取平均值, 结果以x_±s表示。 将100μL浓度为1×109L-1的菌液加入96孔板, 第1-10孔加入按2倍稀