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胡萝卜愈伤组织诱导的研究 胡萝卜是波形科的一种2a类草本植物。由于其丰富、药用价值高，可储存和运输。栽培简单，病虫害少，堆放方便，已成为人们经常食用的蔬菜。同时又因其可食部分-贮藏根具有发达的韧皮部,适合表达外源蛋白,使很多科研工作者乐于用它作为植物生物反应器的受体,尤其是近年来作为表达可食疫苗中较为理想的模式植物之一。而建立一个高效的、实用的组织培养快速繁殖体系则是研究植物遗传转化的基础。近年来,育种工作者不断培育出新的胡萝卜优良品种,而品种间存在一定基因型的差别,受基因型的影响,不同品种间胡萝卜愈伤组织的诱导培养条件也不一致。胡萝卜品种“七寸人参”生长强健,耐抽苔、耐热耐寒、耐旱耐湿,适应性强,高抗病;根型呈圆柱型,颜色鲜红,皮色光滑有光泽,丰产;不易裂根,成品率高,品质佳,耐运输,栽培广泛。因此,该试验以胡萝卜“七寸人参”为试材,研究了激素、外植体、光照、培养基类型等方面对胡萝卜愈伤组织诱导的影响,以期为胡萝卜高频再生、组织培养的工厂化生产及遗传转化奠定基础。 1 材料和方法 1.1 试验材料 胡萝卜栽培品种”七寸人参”,购自杭州金科园艺种苗技术服务部。 1.2 测试方法 1.2.1 无菌苗的诱导培养法 将胡萝卜种子搓去种毛,用自来水清洗数遍,再于室温下用自来水浸泡种子过夜,使其种子吸水膨胀,再用70%的酒精消毒1 min,无菌水冲洗3遍后,用20%的次氯酸钠溶液浸泡14 min,接着用无菌水冲洗4遍,接种在无激素的MS 固体培养基上,在黑暗、(25±1)℃条件下培养,诱导无菌苗。待无菌苗萌发4~5 d后转入16 h/d光照条件下培养2 d后备用。 1.2.2 诱导愈伤组织 将幼苗的下胚轴和子叶切成0.4 cm左右的小段,接种在附加不同激素的MS或B5固体培养基上诱导愈伤组织。诱导条件为全暗或16 h/d光照,每处理接种30个外植体,3次重复,40 d后统计其愈伤组织的诱导和生长结果。愈伤组织的诱导频率=(诱导出愈伤组织的外植体数/接种总外植体数)×100%。 2 结果与分析 2.1 ,4-d与kt对胡萝卜愈伤组织生长情况的比较 将下胚轴接种在附加不同激素和浓度的MS固体培养基上,5 d后下胚轴即开始膨大,随后开始诱导出愈伤组织。由表1可知,所有的外植体在只添加激素2,4-D的MS固体培养基上都诱导出了愈伤组织,诱导频率均为100%,而在不含2,4-D的培养基上没有诱导出愈伤组织(图1-E)。由此可见,2,4-D对胡萝卜下胚轴愈伤组织的诱导有着显著的作用。而在只添加激素KT的情况下,外植体不能诱导出愈伤组织,说明KT对胡萝卜下胚轴愈伤组织的诱导并无作用。在只添加2,4-D的MS固体培养基上,随着2,4-D浓度的增高,诱导出的下胚轴愈伤组织含水量增大,同时部分愈伤组织的表面及边缘处出现粘性增大并结块的现象(图1-B、C),生长明显缓慢。而在添加低浓度(0.1 mg/L)的2,4-D培养基上诱导出的胡萝卜的愈伤组织生长明显地较高浓度下的愈伤组织生长快速,且愈伤组织松散性好,生长情况良好(图1-A)。愈伤组织在后期继代培养中(与原诱导培养基同)生长良好,增殖快速。 试验结果表明,在MS固体培养基上添加2,4-D并配合一定浓度的KT比单独使用2,4-D对胡萝卜愈伤组织诱导的效果更好,愈伤组织增殖更快速而且松散性较好。在2,4-D浓度一定(0.1 mg/L)的情况下,随着KT浓度的增高愈伤组织的诱导情况更好,即G组试验效果比较佳。当低浓度的2,4-D和低浓度的KT结合,即2,4-D浓度与KT浓度相同时,愈伤组织的诱导情况反而不及单独使用低浓度的2,4-D诱导的愈伤组织好( 图1-F),主要表现在愈伤组织的生长明显减慢。2,4-D和KT浓度相当时,对胡萝卜愈伤组织的诱导不利情况在其它试验中也有类似结果。而在KT浓度一定的情况下(0.5 mg/L)与高浓度的2,4-D(1.0 mg/L)结合(D组)或者低浓度的2,4-D(0.1 mg/L)结合(G组),其诱导情况比较相似(图1-D、G),只是后者在生长速度上比前者略微快一些,但松散性比前者略差一些,长时间继代后其生长状况不及D组。由此推测,一定浓度的KT(0.5 mg/L)在胡萝卜愈伤组织的诱导上没有明显的作用,但能促进愈伤组织细胞的分裂速度、促进愈伤组织的增殖。 2.2 诱导分离愈伤组织 每组试验中均以下胚轴和子叶为外植体同时进行了愈伤组织的诱导试验(基本培养基为MS培养基)。结果表明,在各组试验中除了E组试验外,其它试验组均能诱导出愈伤组织,且诱导频率为100%,该试验结果与下胚轴的试验结果类似,但和下胚轴相比,所有子叶诱导出的愈伤组织明显不及相同条件下下胚轴的愈伤组织好,表现为愈伤组织生长非常缓慢,而且松散性比较差,个别比较粘湿(图1-H)。因此,对胡萝卜愈伤组织的诱导以下胚