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转基因大豆遗传转化技术研究进展 大豆来自中国。它不仅是人类最重要的油资源和植物蛋白的来源，也是一个重要的工业材料。它在我国的粮食安全和经济发展中发挥着重要作用。我国大豆种植受自然条件等逆境因子制约常造成减产,同时大豆品种适种范围窄,严重影响优良品种的大面积种植。作物常规育种在提高产量、品质及抗性等方面发挥主导作用,但受有益突变效率和生殖隔离等特性制约,利用有限。而利用转基因技术能把外源抗逆基因(转录因子)引入到作物中,可提高作物抗逆性,被动地提高作物产量。 转基因大豆与其他主要作物相比,遗传转化体系不够稳定,有待完善,转化率有待提高。实现此目标,需要以下体系作支持:(1)良好的植株再生体系(受体系统);(2)DNA导入到再生细胞的转化体系(转化方法);(3)良好的筛选系统和稳定的转化效率。国内大豆生产与加工转基因技术自主研发实力不足,存在转化效率低,重复性差等问题,不少研究者针对不同的遗传转化系统进行改进,以期提高大豆遗传转化效率。 1 中国转移大豆的种植现状及研究 1.1 以抗草甘膦转大豆为主要的转基因作物 国际农业生技产业应用服务中心(International service for the acquisition of agri-biotech applications,ISAAA)资料显示,1996年转基因作物的种植面积为170万hm2,2011年已达到1.6亿hm2,增长94倍,转基因大豆作为主要的转基因作物,占据全球转基因作物种植面积的47%(7 540万hm2)。其中以抗草甘膦转基因大豆(Roundup ready soybean,RRS)种植为主。由于转基因大豆带来巨大的经济效益,种植规模逐年扩大。近几年,中国转基因作物发展迅速,主要是以转基因抗虫棉为主,但转基因大豆尚未进入商业化生产阶段。 1.2 国内外细胞转化和基因转换的进展 Hinchee首次报道成功获得大豆转基因植株,抗草甘膦转基因大豆(RR大豆)和高油酸大豆(HO大豆)在国际上的种植面积不断增加,转基因大豆类型不断增加。我国研究者主要在大豆抗病虫害、抗逆性及大豆油分等重要农艺性状方面获得转基因植株。徐香玲等将PKT54B7C5上的B、T、K-δ内毒蛋白基因通过农杆菌介导法导入大豆黑农37、黑农39等品种,获得再生大豆植株,并且利用同样的方法将抗真菌的几丁酶基因导入大豆品种东农37号、吉林28号等14个品种,得到转化植株。尹青女等向大豆受体导入热激转录因子8(Heat shock factor 8,hsf8)基因,以加强目的基因hsf70的表达和增加转基因大豆的抗逆性。李小平等采用农杆菌介导大豆子叶节转化法,共获得3株转基因植株。该植株RT-PCR分析表明,rlpk2基因已被成功敲减,并发现敲减大豆叶片中的rlpk2基因,明显改善叶片的光合能力。张秀春等经农杆菌介导,采用子叶节转化法转化大豆,获得一批携带有玻璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转基因大豆。国内关于转基因大豆的研究绝大多数都是对转基因植株进行抗性标记筛选、PCR检测以及Southern杂交,仅证明外源基因已整合到大豆基因组中。与国内相比,国外不仅具有自主知识产权的载体和像Bt和EPSP基因一样具有重大应用前景的基因,且基因转化和筛选效率比国内高。 国外转基因大豆产业化引领世界转基因作物的快速发展。如美国Monsanto公司利用基因枪轰击方法将编码5-烯醇-丙酮酸莽草酸-磷酸合成酶(EPSPS)基因转入大豆,培育出Roundup Ready转基因大豆并大面积产业化。相同品质改良的转基因大豆研究也取得重要进展,如转Δ12脂肪酸脱氢酶基因(FAD2-1)大豆,油酸含量达70%,并于1997年获准推广;通过抑制大豆Δ12脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因和ACP-棕榈酸硫激酶(Fat B)基因的表达,减少种子中Δ12脂肪酸脱氢酶含量,同时控制棕榈酸产量,从而实现富集油酸,获得油酸含量高达85%的大豆新品系并己开始大规模种植。 2 制备好的转化受体系统 大豆遗传转化依赖于高效受体系统和转化方法的有效结合,因此,建立良好的受体系统是实现基因转化的先决条件,关系到基因转化的成败。一个良好的转化受体系统应具备高效稳定的再生能力、稳定的可遗传性、对选择性抗生素敏感、对农杆菌侵染有敏感性以及具有稳定的外植体来源。自转基因技术问世以来,研究者先后建立了许多受体系统:(1)直接分化再生系统;(2)体细胞胚受体系统;(3)原生质体再生系统;(4)愈伤组织再生系统;(5)生殖细胞再生受体系统。 随着组织培养技术的不断发展和完善,大豆再生受体系统包括直接分化再生系统和体细胞胚受体系统。 2.1 不同外植体的分离技术 Cheng等首次报道无菌苗的子叶节为外植体,诱导丛生芽获得高频率的再生植株。此外,无菌苗茎尖,成熟胚子叶,幼胚轴