高通量RNA测序技术.pdf

➢RNA-Seq技术背景 测序方法的发展 RNA-Seq原理 RNA-Seq技术优 ➢多种高通量RNA-Seq技术方法 454测序技术 Solexa测序技术 SOLiD技术 HeliScope测序技术 ➢高通量RNA-Seq技术应用及前景 第一代测序技术 1954年，首次利用多聚核糖核苷酸链的降解法实现D A测序 第一代测序技术主要代表为： sanger法：由于dd TP的2´和3´都不含羟基，在D A合成反应中不能形 成磷酸二酯键，因此可以被用来中断D A合成反应。在4个D A合成反应体 系中分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种dd TP，通过凝胶电 泳和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测分子的D A序列。 Gilbert法：与sanger法原理相类似，区别在于Gilbert法是先用特定的化学 试剂标记碱基再用化学方法打断待测序列，而Sanger法是通过dd TP随机中 断合成待测序列。 此外还有焦磷酸测序法、连接酶测序法、杂交测序法等。 第一代测序法存在的弊病：成成本本高高、、速速度度慢慢、、通通量量低低。 第二代测序技术—高通量测序技术 ➢ Roche公司的454测序技术——焦磷酸测序法 ➢ Illumin 公司的Solex 技术 ➢ ABI公司的SOLiD技术——连接酶测序法 与第一代技术相比第二代测序技术不仅保持了高准确度，而且大大降低了测 序成本并极大地提高了测序速度。使使用用第第一一代代SS nnggeerr的的测测序序技技术术完完成成的的人人类类 基基因因组组计计划划，，花花费费了了3300亿亿美美元元巨巨资资，，用用了了三三年年的的时时间间；；然然而而，，使使用用第第二二代代 SSOOLLiiDD的的测测序序技技术术，，完完成成一一个个人人的的基基因因组组测测序序现现在在只只需需要要一一周周左左右右的的时时间间。。 由于第二代测序技术产生的测序结果长度较短，因此比较适合于对已知序列 的基因组进行重新测序，而在对全新的基因组进行测序时还需要结合第一代 测序技术。 第三代测序技术—单分子测序 2008 年, Helicos Biosciences 公司开发了第一 单分子测序仪— HeliScope 遗传分析系统, 与上述3 种高通量测序技术不同的是, 它通过在 单一DNA 分子组成的阵列上进行合成测序, 跨越了文库制备中基于PCR 扩增 的信号放大过程,避免了该过程可能引入的错误, 达到了读取单个荧光分子的 能力。 将以上介绍的第二代、第三代 测序技术 （高通量测序技术）应用 到由mRNA反转录 成的cDNA上, 从 获得来自不同基因的mRNA 片段 在特定样本中的含量, 这就是mRNA 测序或 mRNA-Seq，同样原理,各种 类型的转录样本都可以用深度测序 技术进行高通量检测,统称作RNA- Seq。 RNA-Seq技术与其他转录组学技术比较 454测序技术 Solexa测序技术 SOLID技术 HeliScope测序技术 ➢ 构建的单链DNA 文库未经扩增, 没有规 地排列在平面基板上。 ➢ 每个测序循环中, DNA 聚合酶和4 种荧光标记的核苷酸中的一种流入, 按照 模板序列延伸DNA 链, 阵列中发生了碱基延伸反应的DNA 链就会发出荧光, 并通过CCD 记录下来。 ➢ 经过洗涤, 用化学物质将延伸了的DNA 链上的荧光物质被切除并被移走, 便 可以进行下一轮单个碱基的延伸, 荧光标记的切除以及图像的获取。 几种高通量RNA-Seq技术对比 RRNNAA--SSeeqq 的应用 ➢ 转录本结构研究 ➢ 转录本结构变异研究 ➢ 基因表达水平研究 ➢ 非编码区域功 研究 ➢ 低丰度全新转录本发现 RNA-Seq面临的问题及挑战 ➢ 庞大的数据量所带来的信息学难题, 比如如何 好地诠释和比对鉴定多个类似 的同源基因, 如何