五子衍宗丸和金匮肾气丸促进无精子症模型小鼠生精能力恢复的全基因表达谱比较.docxVIP

五子衍宗丸和金匮肾气丸促进无精子症模型小鼠生精能力恢复的全基因表达谱比较 使用基因芯片技术研究中细胞基因的功能机制是近年来的一种有效方法。由于在机体200余种细胞中只有生精细胞在成熟过程中因细胞质脱逸丧失了DNA损伤与修复系统的特性,决定了其对各种毒害物质最为敏感且发生的突变更容易具有累积效应。人类精液质量随着环境质量的变化呈现普遍下降的趋势引起关注[4~7]。在治疗精液质量异常导致男性不育时中医中药具有特殊优势。五子衍宗和金匮肾气是中医男科精华中的经典名方,临床上大量有效方剂多以此为基础化裁形成。在前期实验中发现,上述两种中药对生精作用具有不同表现,作用机理也存在明显不同。为深入了解其中药基因水平的分子表现和作用靶点,本课题利用基因芯片技术进行了研究。 1 材料和方法 1.1 试剂和试剂盒 五子衍宗丸(批号4030124)、金匮肾气丸(批号5033595)均为北京同仁堂产品;白消安为Sigma公司产品;二甲基亚砜(DMSO)为Axygen公司产品;TRIZOL试剂为Invitrogen公司产品;Ambion Message Amp aRNA扩增试剂盒为Ambion公司产品;Nuc Away柱为Ambion公司产品;无RNA酶的糖原为Invitrogen公司产品。 1.2 小鼠单次注射白消安造模 选择无特定病原菌(SPF级,三级动物)成年12周龄NIH雄性小鼠82只,常规饲养。无精子症动物模型按照白消安诱导常规方法造模,白消安溶解于DMSO中配制成2%药液,68只小鼠单次腹腔内注射给药(40mg/kg),第2天开始出现死亡,观察6周,陆续死亡25只,死亡率36.8%。白消安造模存活小鼠分为五子衍宗丸组16只、金匮肾气丸组17只,按照人临床5倍剂量换算,分别给予五子衍宗丸纯净水悬液(0.048g/d/只)、金匮肾气丸纯净水悬液(0.04g/d/只)。2组连续给药78d(2个小鼠生精周期)。正常对照组14只给予纯净水。 1.3 侧睾丸和附睾丸 所有动物最后一次给药24h后,断脊处理,取出双侧睾丸和附睾,一侧的睾丸和附睾固定于Bouin液中,常规切片;另一侧睾丸,迅速液氮冷冻后,于-70℃冰箱中保存,用于睾丸全基因表达谱研究。 1.4 检测大鼠睾丸中的基因表达 检测采用Phalax公司的Mouse One Array芯片,该芯片以Mouse Exonic Evidence Based Oligonucleotide(MEEBO)设计为基础,每芯片上有29 922个小鼠基因探针和1 800个实验探针。按照TRIZOL试剂使用说明书提取睾丸组织总RNA,变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,反转录合成c DNA第1链、第2链。以双链的c DNA为模板,体外转录反应合成反义RNA(a RNA)。aRNA经过纯化后,用aa-UTP对其进行间接Cy3单荧光标记。经过和芯片预杂交、杂交和洗片后对结果扫描,数据读取。 1.5 差异基因 基因筛选的数据分析以2组间上调或下调2倍为有意义的差异基因。差异基因分析、芯片数据的统计学分析、聚类分析采用Mouse One Array Annotation MOA2 release 2.0软件。 2 结果 2.1 睾丸全基因表达谱的测试 随机选择正常对照组和五子衍宗丸组、金匮肾气丸实验组各5只动物单侧睾丸组织,进行睾丸全基因表达谱的测试分析。实验组睾丸组织总RNA抽提电泳结果显示其18S和28S条带均清晰,说明RNA的纯度达到实验设计要求。 2.2 各组表达的基因 通过计算机扫描和定量分析,在31 722个基因中,检测表达在2倍、4倍、≥6倍明显差异的基因。与正常对照组比较,五子衍宗丸组以基因下调为主,金匮肾气丸组以基因上调为主;五子衍宗丸组和金匮肾气丸组比较以基因下调为主,见表1。 2.3 这两个中药组和正常对照组之间的基因显著增加 两中药组与正常对照组比较共同上调≥2倍的基因32个,表达产物的功能以蛋白合成和嗅觉受体基因为主,见表2。 2.4 中药组和正常对照组的两个共同基因降低 两中药组与正常对照组比较共同下调≥2倍的基因12个,表达产物的功能以结构蛋白的代谢为主,见表3。 2.5 五子衍宗丸组与金九肾丸组的比较有所增加 2.6 五子衍宗丸组与金九肾丸组的比较 由表1可以看出差异表达为2~倍、4~倍、≥6倍下调基因分别为424个、55个、22个,下调基因分析见表6,基因功能分类见表7。 2.7 表达基因表达 对基因表达谱的数据利用KEGG进行Pathway分析,显示差异表达基因主要在脂肪细胞因子信号通路、细胞周期、MAPK信号通路、Wnt信号通路、Notch信号通路、Ecm受体作用、Jak-Stat信号通路、细胞因子-细胞因子受体作用等8个信号通路方面。 3 金保持生精细胞增殖 随着分子生物学技术的不