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五子衍宗丸对无精子小鼠睾丸内生精细胞因表达的影响 唐五子衍宗丸是中学思想的经典方剂，具有补肾益精的功效。这是治疗男性不育和提高精子质量的常用方剂。临床医学中使用的大量有效方剂通常是基于此。对补肾生精药物的研究,多集中在临床疗效的评价方面,缺少相关作用机制方面的基础研究认识。我们在前期的研究工作中发现,五子衍宗丸具有保护、促进诱导睾丸生精干细胞分化并提高精液质量的明显作用。在利用基因芯片技术对五子衍宗丸促进生精过程的作用机制研究中,发现睾丸全基因表达谱中的有关免疫系统具有特殊表现,五子衍宗丸可能通过促进机体免疫功能进而刺激生精细胞,从而使生精能力恢复和增强。现将结果报告如下。 1 材料和方法 1.1 实验动物及饲养 无特定病原菌SPF三级成年12周龄NIH雄性小鼠,25只,购自北京市维通利华实验动物技术有限公司,合格证号:SCXK(京)2009- 2009,自由进食常规饲养。 1.2 糖原和ambion试剂 五子衍宗丸(北京同仁堂,批号4030124),白消安(Sigma公司),二甲基亚砜(DMSO,Axygen公司),TRIzol 试剂盒、无RNA酶的糖原(Invitrogen Life Technologies公司),Ambion MessageAMP aRNA试剂盒(Ambion公司),NucAway柱(Ambion公司)。Mouse OneArrayTM芯片(Phalax公司),该芯片以小鼠外显子寡核苷酸(Mouse Exonic Evidence Based Oligonucleotide,MEEBO)设计为基础,每芯片上有29 922个小鼠基因探针以及1 800个实验探针。 1.3 造模成功小鼠 取15只小鼠按白消安诱导常规方法制备无精子症动物模型:白消安溶解于DMSO中配制成2%药液,40 mg/kg单次腹腔内注射给药,连续观察42 d (6周)。18周龄存活的10只小鼠为造模成功,给予五子衍宗丸纯净水悬液,每只含生药0.048 g/d(按照成人临床5倍剂量换算),连续给药78 d(2个小鼠生精周期)。同批次未造模小鼠10只为正常对照组,每日给予纯净水。每只灌胃量均为0.2 ml/d。所有动物最后一次给药后24 h断脊处理,取出一侧睾丸,迅速液氮冷冻后,于-70℃冰箱中保存。五子衍宗丸组和正常对照组小鼠各选择5只用于睾丸全基因表达谱研究。 1.4 合成cdna 睾丸全基因组表达谱分析RNA样品制备按照TRIzol试剂使用说明书操作,提取小鼠睾丸组织总RNA,变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性,合成cDNA第1链、第2链。双链cRNA产物纯化后,用aa-UTP aRNA对双链cRNA进行间接标记,经过预杂交、杂交和洗片后对结果进行扫描并读取数据。 1.5 mox给药与药物 基因筛选的数据分析以2组间上调或下调2倍以上为有意义的差异基因。差异表达基因分析、芯片数据的统计学分析、聚类分析采用Mouse OneArray(○R) Annotation MOA2(小鼠表达芯片) release 2.0软件。在网站中,对差异表达2倍以上的基因进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书)富集分析。 2 结果 2.1 小鼠基因表达的现状 通过计算机扫描和定量分析,五子衍宗丸组与正常对照组小鼠比较,在检测的31 722个基因中,基因表达具有2倍以上明显差异的上调基因355个(占1.12%),下调基因487个(占1.54%)。见表1、表2。 2.2 聚类分析的结果 部分聚类分析结果见图1。 2.3 小鼠海马糖凝胶电泳的优化 对这些差异基因进行信号通路分析显示,差异基因主要表现在黏附功能、细胞周期、细胞因子-细胞因子受体作用、Hedgehog信号通路、Jak-Stat信号通路、Mapk信号通路、Notch信号通路、Toll样受体信号通路、Wnt信号通路和Fc epsilon RI通路等方面;下调的差异基因主要集中在化学信号途径、泛素介导的蛋白水解、核糖体、胞质DNA的传感途径、白细胞跨内皮细胞迁移通路等。通过KEGG富集分析后发现,MKK4/7、MKK3/6、IL- 3、TNF-α、Grb2、PLA2和P38等7个基因存在于Fc epsilon RI通路中Fc段IgE受体α多肽。见图2。 3 fcep1基因对无精子小鼠睾丸中rap1mrna表达的影响 五子衍宗丸是经典的补肾生精名方,常用于治疗肾虚证和男性不育症,而肾虚与免疫功能密切相关。虽然五子衍宗丸对正常小鼠的非特异性免疫 功能有少量的增强作用,但是在使用环磷酰胺导致的免疫受抑小鼠中,五子衍宗丸可以提高单核细胞的吞噬能力,促进小鼠脾细胞生成抗体的能力。利用基因芯片技术可使我们在很短时间内大规模找到不同处理