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五灵胶囊中柴胡皂苷d在小鼠体内药代动力学研究 五灵胶囊是由柴胡、五味子等中药组成的复方制剂。具有平肝健脾、活血化瘀、治疗乙型慢性肝炎的功效。柴胡在方中为主药,柴胡皂苷d是柴胡中主要成分,具有抗炎、保肝、降低血中胆固醇等药理作用。五灵胶囊中主要成分柴胡皂苷d在小鼠体内的药动学特征未见报道,本文对小鼠ig五灵胶囊后体内柴胡皂苷d的药动学特征进行试验,为临床用药提供实验依据。 1 材料和方法 1.1 胡皂苷的提取纯化 五灵胶囊(Wuling)由西京医院药剂科中药制剂室提供,批号五灵胶囊阴性样品由本室模拟制备:柴胡皂苷d本室提取纯化,白色粉末,熔点212～216°C,经紫外、红外光谱,EI-MS质谱确证,纯度97%。乙腈:色谱级Merck公司;水为三蒸水。日本岛津SCL-6A高效液相色谱仪、C-R3A数据处理器,SPD-6A紫外检测器,硫酸胺为分析醇,西安化学试剂厂;昆明小鼠,购自第四军医大学动物中心,动物合格证号:医动证字SC×K(军)2002-05。 1.2 试验品溶液的制备 乙腈-水(40∶60)流速1.0 mL·min-1,检测波长为204 nm,柱温:室温。取五灵胶囊和五灵胶囊阴性样品分别ig小鼠5.5 g·kg-1,1.5 h采血,分取血浆同样品制备方法制备供试品液,再取正常小鼠血浆+柴胡对照品同法制备供试品液。取各样品供试液20 μl分别进样测定分析柴胡皂苷d的HPLC色谱图。 1.3 灵胶囊给药、血样的制备 昆明小鼠228只,♂,置相对湿度45%～75%、温度23～25°C动物实验室饲养3日,禁食过夜,随意饮水,按体重分层随机分组,每采血时间点为一组,每组4只,五灵胶囊按5.5 g·kg-1ig给药(相当于人体给药剂量10倍,每克药粉含柴胡皂苷d 4.1 mg),分别于给药后0.16,0.32,0.5,1.0,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,10.0,12.0,14.0,18.0,20.0,24.0 h眼眶采血,置于肝素化的离心管内,室温放置30 min,3000 r·min-1离心20 min,分离血浆,每组血浆合并,置-20°C冻存,待测。药物重复实验3次。 1.4 单次给药后小鼠血浆中2. 受试小鼠204只,♂,试验条件同上,按体重分层随机分为大、中、小3个剂量组,每个剂量组68只小鼠,三剂量组分别按体重灌胃给予五灵胶囊(大剂量16.6 g/kg、中剂量11.1 g/kg、小剂量5.5 g/kg),分别于给药后0.16,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,8.0,10.0,14.0,18.0,20.0 h眼眶采血,每个剂量组每个采血点4只小鼠,置于肝素化的离心管内,室温放置30 min,3000 r·min-1离心10 min,分离血浆,合并4只小鼠血浆,置-20°C冻存,待测。观察五灵胶囊3剂量组的主要动力学参数是否一致。 1.5 样品溶液的制备 依时间点取4只小鼠混匀血浆0.7 mL,加0.25 g硫酸胺,旋涡混匀1 min,再加乙腈-甲醇(4∶1)溶液4 mL,混悬3 min,3000 r·min-1离心20 min,取上清液置小蒸发皿内,于40°C水浴上用氮气吹干,残渣加色谱甲醇溶解至1 mL,摇匀,作为样品供试品液,-20°C放置过夜。次日用0.22 μm微孔滤膜抽滤,HPLC进样20 μL,测定,外标法计算含量。 1.6 小鼠血浆中样品液的制备 取小鼠20只,随机分成5组,每组4只,禁食给水,次日灌胃给药后1 h,小鼠按组眼眶采血,离心分离血浆,每组小鼠血浆合并,混匀,每组分取0.7 mL血浆,按血浆样品制备方法制备样品液,多人同法操作共制得5份样品液,HPLC法测得5份样品含量。再取对照样品和供试样品液按样品测定方法测定峰面积并计算含量,照样品和供试样品液放置4°C冰箱内,日内每3 h测定1次,共测5次,日间每日测1次,共测5次。 2 结果 2.1 小鼠血浆中柴胡皂苷d的分离 在此条件下,五灵胶囊吸收入血的其它成分或代谢产物均可达到基线分离,小鼠血浆中柴胡皂苷d可得到良好的分离,峰形基本对称,滞留时间适宜为11.21 min。五灵胶囊阴性样品血清和空白血清对测定无干扰,结果见图1。 2.2 血药浓度测定 取空白血浆0.7 mL,一式7份,加入柴胡皂苷d对照品溶液,使血浆终浓度分别为6.25,12.5,25,100,200,400,800 μg·mL-1,按血浆样品的处理方法操作制备样品并测定峰面积值,以峰面积值对血药浓度作图,得回归方程Y=-6370+1364C r=0.9999。线性范围6.25～800 μg,最低检测限5 μg·mL-1。 2.3 样品制备和回收率 取给药后的混合血浆