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植物组织培养常见污染及控制 自20世纪30年代建立以来，经过70多年的理论研究和技术开发，植物组织培养技术在快速繁殖优良苗木、无病毒苗、育种、细菌资源保存和工艺苗等方面呈现出广阔的潜力和视角。然而，传统的组织培训过程中仍然存在一些不利因素。作者分析了影响的一般因素，如腐败、玻璃化、黄化和变化率高的问题，并总结了其解决方案，以期成为培训专家。 1 减少组培污染,提高生活质量 传统组培过程繁杂的技术环节都是围绕防止污染而制定的,控制污染是组培过程中的首要技术,也是组培研究和工厂化生产中最令人头疼的问题。因此要把污染率降低到可以接受的范围,来提高组培苗的质量和产量。一般而言,组培污染来源分三大类:第一类材料带菌;第二类接种污染;第三类培养过程感染。 1.1 材料的污染率 材料带菌是指原始材料本身带菌,或者继代培养的材料本身带有病菌。 1.1.1选择合理的外植体种类、取材的季节、时间、初代接种选取大小适宜的外植体。 (1)外植体种类。植物的病虫害、自身带菌不但对植物自然栽培条件下的正常生长造成了影响,而且严重阻碍了组培过程中的大量繁殖速度。因此在组培中应选取带菌较少或不带菌体的材料作为外植体。一般来说,具有块根块茎和鳞茎类的植物由于这些器官长期生长在存有大量微生物的土壤环境中,造成了本身带有很多细菌,故应避免这些材料作为外植体。半夏的组培中选择珠芽为外植体繁殖好于块茎;而一些具有鳞茎的百合类花卉,选择无菌苗、未开放的花蕾为接种材料好于鳞茎。如赵庆芳等在晶体百合组培中发现,选取的材料不同污染率也有所不同,鳞片、花葶、盘茎的污染率分别为28.5%、0、66.0%。 (2)外植体的大小。大的材料有较大的表面积,带菌相对较多;小的材料,相应地带菌较少,因而污染率较少。孟杨等在湖北百合组织培养技术研究中发现,接种时分割的鳞片大小不同,污染率也有所不同。0.5 cm×0.5 cm的鳞片,污染率为5%,0.8 cm×0.8 cm的鳞片,污染率达到8.3%。 1.1.2预处理方法、消毒药剂的种类、浓度、时间及方法。 (1)预处理的方法:对母株预处理;改善植株栽培环境;对母株喷布杀菌剂或抗生素。对母株或外植体的预处理:促发新枝;黄化处理;热击;用抗生素进行预培养。邢震等对比野外直接采用外植体和经室内黄化处理的外植体组织培养效果分析发现,经黄化处理的外植体污染率低,但分化率明显没有野外直接采用的外植体高;李群等用48 ℃的水浴处理材料效果最好,污染率控制到了较低水平,且对材料没有副作用。 (2)改善灭菌方法:真空减压灭菌;磁力搅拌、超声波振动;多次消毒(灭菌);使用混合消毒液;灼烧。周俊辉等对玛丽安万年青采用减压灭菌,利用减压抽走植物组织中的气体使消毒剂更易进入植物内部,从而增强杀菌效果,使污染率从对照的 93.3%降低到 40.0%。郭海滨等将卷丹百合鳞片先以浓度70%酒精浸泡10 s 再用浓度0.1%HgCl消毒12 min,污染率达到65%,而如果先用酒精浸泡30 s,再用升汞浸泡15 min,污染率可降到15%;王丽娟等在卷丹百合珠芽的组培过程中对接种时外植体的消毒时间做了研究,发现先用浓度75%酒精浸30 s,再用浓度0.1%升汞分别消毒3、5、8、10 min,最佳灭菌效果为升汞消毒5 min。许婉芳等将杀菌剂加入金线莲培养基中,发现50%多菌灵的效果优于70%甲基托布津和25%甲霜灵,其抑菌率达100%且能促进金线莲的生长。 (3)在培养基中加入其他抑菌剂。本身带有内生菌的植物,由于细菌潜伏较深,表面消毒方法无法将其消除,初次培养无污染现象出现,但随着继代次数的增加,菌量逐渐累积,污染现象也会随之而出现。黄小荣等认为植物组培中细菌污染的原因是休眠细菌芽孢萌发的结果,她在香水白掌的组织培养中,通过连续添加青霉素,抑制细菌污染,使培养体生长健壮。周俊辉等在万年青茎段培养中,在培养基中加入50 mg/L利福平和 50 mg/L 氯霉素,使其污染率从原来的81.55%降低到15.62%,有效防止了外植体的污染。 1.1.3切分潜在的带菌材料时,要保证所用的接种工具经过彻底的消毒再去切割其他的健康材料。 1.1.4继代培养时,每次继代之前都要对继代的材料进行仔细的检查,污染的材料应给予丢弃。 1.2 接种室消毒、清洗超净工作台 接种污染指接种过程将病菌带入培养材料,可能原因有:无菌室消毒不彻底或超净工作台滤出的空气中带菌超标;交叉污染;操作人员呼吸或身体、衣物上带有杂菌。 1.2.1紫外灯接种室消毒,清洗超净工作台。 1.2.2接种工具、材料不要与酒精灯、超净工作台铁网面、台面接触。 1.2.3接种人员接种时用酒精棉擦手或用浓度为75%的酒精喷洒双手,接种时避免说话,接种的材料、工具不能超出工作台面,接种人员身体应尽量远离台面,接种时应穿上无菌的白