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烟草组织培养研究 草属植物，属于茄子科。它是一种含有咖啡因的碱性草本植物。它对昆虫没有伤害，但它会刺激人类的神经兴奋，对神经也有很强的选择性。一些杂草也可以用来制作杀虫剂、烟碱、苹果酸、柠檬酸等。 目前,烟草一般采用有性繁殖,但繁殖的烟苗不均衡,易发生变异,而且易感病菌,造成多种病害发生,品质退化,从而影响经济收入.而通过组织培养技术,可以保持烟草优良品种的优良性状,减少病虫害,从而达到高产优质的目的.有关烟草组织培养已有不少报道,主要体现在以烟草叶片作为外殖体,近几年研究重属对烟草中片组织培养的影响也有部分报道.本研究以烟草幼嫩叶片、茎段以及带有叶片的茎段等为外植体,对其组织培养技术进行更全面、系统的研究,以期为烟草的大规模生产和新优品种的快速推广奠定基础. 1 材料和方法 1.1 材料表面 取烤烟品种K326的幼嫩叶片、茎段和带有叶片的茎段作为外植体. 1.2 方法 1.2.1 %水冲洗 灭菌流程:外植体→流水冲洗 30 min→洗涤剂溶液浸泡 10 min→流水冲洗 30 min→(以下工作在超净工作台完成) 75%酒精浸泡30 s→无菌水冲洗 2次 (1 min1次 )→0.1%HgCl浸泡 8min→无菌水冲洗 6次 (2 min1次 ). 1.2.2 b.2.2细胞培养液的制备 取九个锥形瓶分别编号为A.1,A.2,A.3,B.1,B.2,B.3,C.1,C.2,C.3,向其中各加入50 mlMS培养基和0.8%~0.9%琼脂,全部用封口膜封好,灭菌与消毒后备用. 1.2.3 激素种类的选择、接种及观察 待锥形瓶冷却到热但不烫手时,按照下表,向锥形瓶中分别加入激素.待锥形瓶完全冷却,琼脂凝固时,按照表1所述,植入外植体,保证外植体的断口插入琼脂内. 更换激素种类时,要先打掉移液枪的枪头.接种完毕后,要使锥形瓶的瓶口在酒精灯的外焰上燎灼数秒,燎灼时要旋转,避免烧坏.再把封口膜的内侧迅速通过酒精灯外焰,盖好封口膜. 每隔一星期观察记录各组生长发育情况,统计叶片接种后面积变化、烟草茎+叶接种后再分化新叶数以及茎段接种后形成的愈伤组织横截面积变化,以确定不同类型培养基对烟草外殖体分化的影响. 2 结果与分析 2.1 叶片剥削率 随日期推移,叶片在不断长大.同时,叶片基部与培养基接触的部分逐渐脱分化,颜色变黄再变白,不断变浅,逐渐变得半透明.基部脱分化形成的愈伤组织生长较快,导致上边叶片卷曲.在第三周,A.1组再分化出根,培养基中的根长8 mm,在培养基外的根生出大量根毛(图1);第四周,A.1组的根进一步伸长,暴露在空气中的根更长. 对于A.1组,B.1组,C.1组接种后的变化记录如表2: 2.2 第4组.2组.4代.4和5.2组.8.2.3和10.2%.前叶的生成 带有茎的叶片脱分化、再分化速度较快,基部膨大变得透明,脱分化形成大的愈伤组织,顶部生长迅速,很快生出大量新叶块.在第四周,A.2组再分化出根,暴露在空气中的根生出大量根毛(图2).原有的老叶变黄枯萎,逐渐死亡,大量新叶展开. 对于A.2组,B.2组,C.2组生出的新叶片数目(原有的一片老叶不计)记录如表3: 2.3 叶片的分化 烟草茎段接种后,生长趋势较弱,基部膨大,脱分化形成愈伤组织,逐渐再分化出叶片.刚分化出的叶片黄绿色,半透明,逐渐展开后绿色(图3). 对于A.3组,B.3组,C.3组的愈伤组织的生长记录如表4: 对于A.3,B.3,C.3组的愈伤组织横截面积记录如表5: 3 分析与讨论 3.1 激素对根分离的影响 把烟草的叶片、茎+叶片、茎段分别接种到生长素和细胞分裂素含量比例不同的MS培养基上,诱导分化.只在0.5 mg·L-1NAA + 0.1 mg·L-16-BA的激素条件下先再分化出叶,随后再分化出根,在0.1 mg·L-1NAA + 0.5 mg·L-16-BA 和0.5 mg·L-1NAA + 0.5 mg·L-16-BA的激素条件下,只能分化出茎和叶.实验表明,NAA浓度高于6-BA浓度时,有利于根的分化;NAA浓度低于6-BA浓度时,有利于芽的分化,抑制根的分化.NAA浓度同为0.5 mg·L-1的两组中,6-BA浓度为0.1mg·L-1时,有根分化形成,在6-BA浓度为0.5mg·L-1时不能分化形成根,表明高浓度的6-BA抑制根的分化.在实验浓度范围内NAA浓度变化对茎和叶的再分化作用不显著,高浓度的6-BA有利于促进茎和叶的分化. 3.2 形态不稳定因素:细胞成熟程度为小 在相同的培养基中分别接种烟草的叶片、茎+叶片、茎段,实验结果表明,带有叶片的茎最容易诱导脱分化、再分化,仅有茎的外植体脱分化较容易,仅有叶的外植体的生长较快,但脱分化再分化较缓慢.导致这一结果的可能原因,一是细胞的成熟程度的影响;二是外植体中的激素与培养基中的