第二章预处理技术.pptVIP

缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。 （2）自溶法（Autolysis） 诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、缓冲液浓度和细胞代谢途径等。 第六十一页，共九十六页，2022年，8月28日 某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。 （2）化学试剂破碎法（Chemical permeation） 该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。 用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外的大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解成游离的氨基酸。 第六十二页，共九十六页，2022年，8月28日 如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠、吐温等也可使细胞破碎。 表面活性剂 可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。 第六十三页，共九十六页，2022年，8月28日 处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。 EDTA螯合剂 第六十四页，共九十六页，2022年，8月28日 能溶解细胞壁中的磷脂层，使细胞破坏。 有机溶剂 变性剂 盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。 常用的有机溶剂：丁酯、丁醇、甲苯、二甲苯、氯仿及高级醇等。 变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。 第六十五页，共九十六页，2022年，8月28日 通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50% 有些化学试剂有毒 。 化学法的优点： 缺点： 对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。 第六十六页，共九十六页，2022年，8月28日 细胞破碎方法（按是否使用外加作用力） 分 类 作 用 机 理 适 应 性 机 械 法 珠磨法 固体剪切作用 可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难 高压匀浆法 液体剪切作用 可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌 超声破碎法 液体剪切作用 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作 X-press法 固体剪切作用 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合 非 机 械 法 酶溶法 酶分解作用 具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差 化学渗透法 改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差 渗透压法 渗透压剧烈改变 破碎率较低，常与其他方法结合使用 冻结融化法 反复冻结-融化 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物 干燥法 改变细胞膜渗透性 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 第六十七页，共九十六页，2022年，8月28日 细胞破碎方法： 机械法 非机械法 缺点：固－液分离较困难。 优点：设备通用性强、破碎率高、操作时间短、成本低、大多数方法适于大规模生产。 缺点：破碎率低、耗时、成本高、一般适合小规模生产。 优点：固－液分离容易。 第六十八页，共九十六页，2022年，8月28日 对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。 三、混凝 对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理； 第二十九页，共九十六页，2022年，8月28日 第四节 细胞破碎  一、细胞壁结构和特点 二、细胞破碎率效果的检验 三、细胞破碎的方法 四、选择破碎方法的依据 五、破碎技术的发展方向 第三十页，共九十六页，2022年，8月28日 细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。 概念 第三十一页，共九十六页，2022年，8月28日 微生物 革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌 酵母菌 霉菌 壁厚/nm 20-80 10-13 100-300 100-250 层次 单层 多层