2株茶小绿叶蝉的胞外蛋白酶活性测定及防治药剂筛选.docxVIP

2株茶小绿叶蝉的胞外蛋白酶活性测定及防治药剂筛选 茶小绿叶蝉是同科茶叶科的成员。它是一种严重的有害茶树害虫。昆虫和成年雄性和雌性寄生虫直接吸收茶叶的细腻芽和叶，严重影响茶叶的产量和质量。这是高产和优质茶叶的重要限制因素。我国以假眼小绿叶蝉E.vitis为优势种,它具有寄主范围广、繁殖力强、地理分布广、世代重叠复杂的特点;目前仍以化学防治为主,一些化学杀虫剂的长期过量使用使其产生不同程度的抗药性,防治效果欠佳,导致茶叶损失达10%~30%,防治费用占到茶树病虫害总防治费用的40%~60%,因此成为我国茶园最重要的害虫。积极探索环境友好的生物防治方法,开发经济有效的生物农药是目前无公害茶叶生产亟需解决的问题。 昆虫病原真菌是害虫的重要天敌,具有环境友好、主要通过寄主体壁侵染等特点,因此对防治刺吸式口器昆虫有其它昆虫病原微生物无法比拟的优势,现已有100多种产品在国外注册、14种产品在国内登记,用于防治鞘翅目、鳞翅目、同翅目和螨类等多种农林有害生物[8～12]。多年来,人们一直关注开发用于防治茶小绿叶蝉的真菌杀虫剂。濮小英和冯明光研究球孢白僵菌Beauveria bassiana和玫烟色棒束孢Isaria furmosoroseus的纯孢子悬乳剂及其与3%吡虫啉10%可湿剂的混配剂对茶小绿叶蝉的防效,发现球孢白僵菌和玫烟色棒束孢的纯菌剂间隔12 d处理两次第25 d的防治效果分别为49.5%和19.0%,球孢白僵菌和玫烟色棒束孢混配剂的防效可分别达66.8%和62.1%,而含微量吡虫啉的矿物油为50.3%。这两种真菌的纯孢子悬乳剂防效皆较低,可能与菌种不是小绿叶蝉分离株有关。 本研究立足于对茶小绿叶蝉,特别是茶小绿叶蝉田间僵虫的调查分离,通过毒力生物测定筛选出致病力强的菌株,将其孢子粉配制成合适的剂型,进行茶园茶小绿叶蝉防治试验,以开发专门用于防治茶小绿叶蝉的真菌杀虫剂。 1 材料和方法 1.1 芽孢子粉的制备 供试的5株菌株皆从安徽省采集,包括1株分离自茶小绿叶蝉Empoasca spp.的爪哇棒束孢Isaria javanicus RCEF4687和4株分离自其它叶蝉的球孢白僵菌RCEF1852、RCEF1877、RCEF2030和RCEF2123,均保存于安徽农业大学微生物防治省重点实验室。菌种以孢子粉和灭菌的脱脂奶粉混匀后封存于冻干管并保存到-125℃超低温冰箱中。 生产孢子粉时,先将供试菌株在SDAY斜面上培养7 d左右,然后刮取孢子接入SDY培养液(不含琼脂的SDAY)中,在(25±1)℃、125 r?min-1振荡培养48 h后,将菌液转接入装有新鲜SDY培养液的70 L气升式发酵罐中通气培养48 h;将所获含有大量菌丝段的菌液按1∶10的比例接种到经高压灭菌至适当熟度的大米上,充分混匀后,平铺于60 cm×40 cm×5 cm的浅盘中,厚度3 cm,每盘1500 g。在(25±1)℃、12L:12D光周期条件下固体发酵产孢12 d左右,然后将发酵物料置于28℃冷凝干燥72 h,用Mk-Ⅴ型Myco Harvester收孢机(CABI Bioscience)收集孢子粉。再用冻干机Labconco-12L(Labconco Company,Kansas,America)在常温真空条件下将孢子粉干燥24 h,使孢子粉含水量不超过5%。活孢率在95%以上,4℃下冷藏备用。 1.2 菌种培养和处理 明胶琼脂培养基测定法:参照Bidochka和Khachatourians的方法。培养基由1%的明胶和1.5%的琼脂(W/V)配成。各供试菌株配成1.0×108孢子?mL-1的菌悬液,取8μL滴于带培养基的培养皿中心处,每菌株3次重复,(25±1)℃培养3 d后,用15%(W/V)Hg Cl2(溶于2 mol?L-1HCl中)溶液处理培养皿,菌落周围显现出清晰的透明圈后,倒去Hg Cl2液。用卡尺量度纵横两个方向的透明圈直径(D)及菌落直径(d),以透明圈与菌落直径平均值之比(D/d)作为胞外蛋白酶产酶量的指示值。测出的透明圈直径与菌落直径之比值越大,表明胞外蛋白酶活性越强,产酶水平越高。 1.3 假性眼病的室内生物测定试验 1.3.1 试验昆虫的来源 1.3.2 菌株的回复突变第251 将1.2中筛选出的3株菌株的孢子粉用0.1%Tween-80水溶液分别配成5个浓度梯度的孢悬液,即1×104、1×105、1×106、1×107、1×108孢子?mL-1,以0.1%Tween-80水溶液作为对照,采用Potter喷雾塔(Burkard Scientific Ltd.)喷雾接种。每菌株各浓度处理重复5次。 喷雾前将假眼小绿叶蝉低龄若虫经过CO2麻醉,用排笔将昏厥的叶蝉小心而迅速地转移到培养皿中,并立即置于Potter喷雾塔直径11