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小麦制曲过程中的微生物种群结构变化 小麦在黄酒的生产中发挥着非常重要的作用。由于其质量的好坏，它直接影响到黄酒的产量和质量。因此，小麦草有“酒的骨头”的美誉。传统的黄酒酿造采用的是自然固态发酵培养的生麦曲,以小麦为原料,通过网罗自然界中微生物,在堆放车间中进行自然接种,使附着在小麦表面的微生物生长繁殖并代谢产生各种代谢产物。制曲过程也就是在微生物的参与下,发生着一系列的生物化学变化的过程。通常整个制曲过程根据麦曲品温的变化分为6个阶段:起始期(麦曲制作成型后堆放在曲房的第1天),发酵前期(麦曲进入曲房的第2天),升温期(第3天,微生物大量繁殖并开始产热,麦曲品温逐渐上升),高温期(第4天,麦曲品温达到最高温度51～55℃,耐热性差的微生物因高温环境而失活死亡,而一些霉菌则停止生长,产生孢子),降温期(第5～7天,及时的开窗通风措施使得麦曲品温逐渐回落),成熟期(培养至25～30天,麦曲品温与室温相近,麦曲中水分含量逐渐降低,微生物停止生长,麦曲已结成硬块,即已成熟)。由于麦曲品温和水分含量的变化,不同时期麦曲中参与发酵的微生物不同,所参与的反应以及产酶情况也有所不同。 目前对黄酒麦曲制曲过程的研究,一般多是通过酶活力的测定来研究制曲过程中主要水解酶系的活力变化,而对于这些同功酶的构成及其来源等,往往不能进行全面而有效的分析。在麦曲制曲过程中微生物群落的动态变化研究方面,目前主要是利用传统的分离培养鉴定结合分子生态学方法,如核糖体内转录间隔区序列分析(RISA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)。然而,利用这些方法所获得的研究结果无法将麦曲中存在的特定微生物与其分泌的特定胞外酶联系起来,从而达到深入理解黄酒麦曲固态发酵机理的目的。近几年来迅速发展起来的宏蛋白质组学理论和技术将可能解决这一问题。 目前主要应用于环境微生物生态系统研究的宏蛋白质组学,其定义是运用蛋白质组学技术对微生物群落进行研究的一项新技术,是从微生物群落的所有蛋白质水平上直观揭示复杂生态系统中微生物的功能及其变化。本研究利用宏蛋白质组学的理论和方法,将麦曲样品浸提液中所有可溶性蛋白定义为待研究的“宏蛋白质组”,对麦曲制曲过程中的宏蛋白质组动态变化情况进行分析,所获得的研究结果将有助于深入理解麦曲发酵过程机理。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 典型时期的样品采集 2010年夏秋,在绍兴某黄酒厂制曲车间跟踪两批麦曲在制曲过程中的温度和水分含量变化,分别采集第1天(起始期)、第2天(发酵前期)、3天(升温期)、4天(高温期)、6天(降温期)和30天(成熟期)的麦曲,作为制曲过程中6个典型时期样品。 1.1.2 蛋白定量试剂 琼脂糖、溴酚蓝、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰铵(IAA)、固相IPG干胶条(18cm,pH3～10,非线性)、IPG 缓冲液(pH3～10,非线性)、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)、尿素,为GE公司产品。IPG覆盖液、RC-DC蛋白定量试剂盒,为Bio-Rad公司产品。Complete蛋白酶抑制剂混合片,为Roche公司产品。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS)、过硫酸铵、考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250,为上海生工进口分装产品。甲醇、正丁醇、甘油、冰醋酸、磷酸、三氯乙酸(TCA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、丙酮、乙酸钠、牛血清白蛋白,均为国产分析纯产品。 1.1.3 仪器和检测设备 等电聚焦电泳仪Ettan IPGphor 3、Ettan DALTsix垂直电泳系统和ImageScanner扫描仪,均为GE公司产品;CR22G型高速冷冻离心机,日本日立公司;Pico Fresco17微量高速冷冻离心机,Thermo公司;UV-2100型紫外可见分光光度计,尤尼柯仪器有限公司;脱色摇床TS-1,海门市其林贝尔仪器公司。 1.1.4 dti不影响溴酚蓝贮藏液 样品水化液:尿素4.8 g,CHAPS 0.4 g,IPG缓冲液50 μL,加入双蒸水至总体积为10 mL(使用前加入50 mmol/L DTT)。 平衡液 I:尿素72.07 g,SDS 4.0 g,1.5 mol/L Tris-HCl 6.7 mL(pH 8.8),甘油69 mL,1%溴酚蓝贮存液400 μL,加入双蒸水至200 mL,使用前每10 mL加入DTT 100 mg。 平衡液 II:尿素72.07 g,SDS 4.0 g,1.5mol/L Tris-HCl 6.7 mL(pH 8.8),甘油69 mL,1%溴酚蓝贮存液400 μL,加入双蒸水至200 mL,使用前每10 mL加入IAA 250 mg。 1.2 方法 1.2.1 样品制备 (1) com