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冠心病血瘀证与一般血浆中的蛋白组分析 冠状动脉硬化是一种严重危害人类健康的常见疾病。它的发生与脂质代谢障碍、血管内皮细胞损伤、单核细胞移植和切下致切物细胞分离以及mcclovac细胞的形成、细胞坏死和脂质积累有关。血瘀证是冠心病的常见中医证型,活血化瘀是治疗冠心病的常用方法。先前通过的血液流变学、微循环和分子生物学等方法对冠心病血瘀证进行了大量的实验与临床研究,对揭示证的实质起到了重要作用。 蛋白质组学是一种新的研究手段,蛋白质组是指由一个基因组、一种生物或一种细胞/组织表达的所有蛋白质。蛋白质组研究的技术路线主要是高通量双向电泳进行蛋白质的分离,再用专业计算机软件进行图像分析,然后通过质谱技术及蛋白质数据库信息对凝胶上的蛋白质进行分析和鉴定。由双向电泳、质谱、计算机图像数据处理组成的蛋白质组学的技术体系具有高通量、高分辨率和高重复性的特点,能对微量样品进行全面自动定量分析,并在疾病诊断物的发现、药物作用靶标、安全性评价、耐药性机制、疾病动物模型研制和中医药现代化等方面得到应用。而应用于临床诊断的疾病标志物应该是容易获取并易于随时检测的,正是基于这样的考虑,我们采用蛋白质组学技术比较正常人与冠心病血瘀证病人血浆中的蛋白质差异,以期发现冠心病血瘀证病人血浆中的诊断标志物。 1 数据和方法 1.1 诊断标准的制定 选择2003年10月—2004年2月住院的冠心病血瘀证病人8例,均符合WHO/ISEC 1979年制定的《缺血性心脏病的命名和诊断标准》及中国中西医结合活血化瘀研究专业委员会1986年制定的血瘀证诊断标准,年龄55岁~65岁。正常健康人(对照组)8例,为本院健康查体者,年龄54岁~65岁。 1.2 培养液、胎牛血清及去蛋白试剂 IPG缓冲液、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等双向电泳试剂均购自Amersham pharmacia公司;DNA和RNA酶购自Sigma公司;蛋白质酶抑制剂、胰酶购自Roche公司;二甲基甲酰胺、赖氨酸购自Roche公司;蛋白质定量标准考马斯亮蓝R-250、考马斯亮蓝G-250购自Amresoco公司。DMEM培养液、胎牛血清购自GIBCO公司,肿瘤坏死因子(TNF-α)购自Sigma公司。去除白蛋白试剂盒购自Pierce公司。仪器为Amersham pharmacia公司蛋白质学研究配套仪器:IPGphor等电聚焦仪,Ettan DALTsix双向垂直电泳仪,MultiTemp Ⅲ 温控循环水浴,Image Scanner扫描仪,Imagemaster 2D Elite 图像分析软件,Imagemaster 2D Database 数据库软件,Typhoon 9410扫描 1) 本课题为北京中医药重点学科项目,北京中医药“125”人才培养计划项目 仪,Decyder Differential in-gel Analysis Version 4.00.06和Biological Variation Analysis图像分析软件。 1.3 理论血浆蛋白样品,进一步扩大血浆相对于人体的覆盖面 取1 mL抗凝血液,4 ℃放置30 min后,离心(3 000 r/min,15 min),取上清转移至Ep管,离心(7 500 r/min,30 min),取上清,从8份血浆样品中各吸取100 μL血浆合并,得到正常人和病人血浆蛋白样品。 1.4 抗白蛋白抗体 从血浆中去除白蛋白:加抗白蛋白抗体株到离心管中,然后加380 μL双蒸水作用20 s,离心(12 000 r/min,1 min),弃去洗脱液。加80 μL血浆到离心管中,与抗白蛋白抗体反应1 min,离心(12 000 r/min,1 min),收集洗脱液,将洗脱液再加到离心管中,再次与抗白蛋白抗体反应1 min, 离心(12 000 r/min,1 min),收集洗脱液。加50 μL缓冲液到离心管中,与抗白蛋白抗体株反应1 min, 离心(12 000 r/min,1 min),收集洗脱液。将洗脱液合并,得到去除白蛋白的血浆蛋白样品。 1.5 ndad染色 将蛋白质定量标准(Albumin standard)梯度稀释后用考马斯亮蓝G-250染色,波长595 nm测定吸收度,做标准曲线,样品稀释100倍测定蛋白质浓度。 1.6 ipg胶条的等电聚焦 分别取正常和TNF-α处理细胞的蛋白质制成第一向等电聚焦体系。采用胶内泡涨方法,样品和泡涨液(8 mol/L尿素、2% CHAPS、20 mmol/L DTT、0.5% IPG缓冲液、痕量溴酚蓝)共450 μL,揭下IPG胶条的保护膜,胶面向下,先将IPG胶条尖端朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中,慢慢下压胶条,并前后移动,避免生成气泡,最后放下IPG胶平端,使溶胀液浸湿整个胶条,从IPG胶条两侧加入Immo