柚皮提取物的分离纯化及其抑菌作用的初步研究.docxVIP

柚皮提取物的分离纯化及其抑菌作用的初步研究 结果表明，葡萄柚提取物不仅对金黄色细菌、杆菌和伤寒杆菌具有较高的抗菌活性，而且对抗真菌药物具有强烈的抗菌活性。Negi等人也证实,葡萄柚中正己烷提取物的醇溶组分有较强的抑菌活性,且对革兰氏阳性菌更为有效。但是对于柚皮提取物抑菌的研究,国内仍处于探索阶段,与之相关的文献报道和研究很少,仅林捷等研究了柚皮的乙酸乙酯提取物的抑菌作用。证实了其对苏云金芽孢杆菌、卵黄色八叠球菌以及酸泡菜中分离的混合细菌有很强的抑制作用。 研究中通过采用乙醇提取柚皮中的活性成分(主要为柚皮黄酮),选择了几种细菌、霉菌,对柚皮提取物的抑菌作用进行了初步的研究,旨在为我国柚子的综合开发利用提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 主要真菌 柚皮提取物:自制,总黄酮含量为10.9%。 葡萄柚原液:湖北庆生堂医药集团有限公司。 菌种:供试大肠杆菌(Escherichia coli)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、灰绿青霉(Penicillium glaucum)均由我校畜牧兽医学院提供。 培养基:牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖马铃薯(PDA)培养基。 1.2 方法 1.2.1 提取液浓缩液的制备 称取柚皮干粉200g,以60%的酒精浸提干粉2次,第1次以20∶1的料液比浸提,第2次以10∶1的料液比浸提,抽滤得到柚皮提取液。真空浓缩,得到浓缩液。将浓缩的乙醇提取液上NKA9大孔树脂柱,用蒸馏水洗脱,至洗脱液中不在含糖,然后用60%的酒精进行洗脱,将洗脱液重复上柱, 收集60%乙醇洗脱液,回收溶剂,冷冻干燥后制得样品。置于干燥器中备用。经芦丁标准比色法测定,提取物中总黄酮含量为10.9%。 1.2.2 关于橙色提取物的抗菌活性研究 1.2.2. 柚子皮提取物的制备 菌悬液的制备:取大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面,37℃培养约24 h,用接种环从斜面上挑菌到100 mL无菌水中制成菌悬液,稀释10倍,并通过混平皿计数,确定菌液的稀释度,使最后的菌悬液所含活菌量在1×106~1×107?cfu/mL。 接种培养:无菌操作下,用取液器吸取相同体积的菌液和不同浓度的柚皮提取物到灭菌小离心管中,充分混匀后,迅速注入200 μL到灭菌平皿中,每种浓度的柚皮提取物做2个平行,以菌液和同体积的无菌水的混合液注200 μL作空白,也可直接注入菌液100 μL作空白;倒入已灭菌置45℃下恒温的培养基10~12 mL(每次实验平皿中培养基倒入量应保持一致),晃动平皿使混合液充分散开,均匀分布到平皿上,待培养基凝固后,置37℃培养箱中培养1~2 d观察菌落生长情况,并对菌落计数。以下式计算抑菌率: 抑菌率(%)=空白皿菌落数-样品皿菌落数空白皿菌落数×100% 1.2.2. 设置滤纸片、培养基 菌悬液及柚皮提取物的制备:直接用接种环挑取已经活化好的斜面菌种到无菌水中制成菌悬液(含活菌量较大,以便抑菌实验中可以致密接种)。用无菌水倍比稀释配制5%、2.5%、1%、0.5%四个浓度的柚皮提取物,用无菌水稀释配制1∶50的葡萄柚原液。 滤纸片的制备及处理:用灭菌镊子取烘干后的灭菌滤纸片到配制好的柚皮提取物中浸2 h,置30℃烘箱中烘干备用。以无菌水浸过的滤纸片做空白。 接种培养:无菌操作下,倒入灭菌过的培养基制成平板,将菌悬液注100μL到平板上,用涂布棒涂抹均匀后放置约30 min后以无菌操作将含柚皮提取物的5.5 mm滤纸片贴到培养基上,每个平皿贴全所有浓度及空白的滤纸片,共计6张,每种菌做2个平行;置37℃培养箱中培养1~2 d观察测量抑菌圈直径大小。 1.2.2. ph值的确定 不同pH值培养基的准备:配制普通牛肉膏蛋白胨培养基,分为3份,调节pH值分别为5、6、7,121℃灭菌20 min备用。 菌悬液制备及接种培养:同MIC法,所用柚皮提取物浓度为1%。 1.2.2. 菌悬液的制备 样品的处理及制备菌悬液:取1%的柚皮提取物,用4支小离心管分装,1支于室温(20~25℃)下放置,另外3支分别置50℃、80℃、100℃的不同烘箱中处理2 h,取出备用。以无菌水稀释已活化好的大肠杆菌和沙门氏菌种制备含活菌量1×106~1×107?cfu/mL的菌悬液备用。 接种培养:同1.2.2.3节。 1.2.2. 生长平板的制备 霉菌菌种的活化:制备PSA培养基斜面,取黑曲霉、米曲霉、青霉菌种接种到斜面上活化24 h,取活化菌再次接种到斜面上进行2次活化48 h,备用。 接种培养:无菌操作下,用取样器吸取5%柚皮提取物到6个灭菌平皿中,每种菌做两个平