木聚糖酶色谱纯化技术的研究进展.docxVIP

木聚糖酶色谱纯化技术的研究进展 木聚糖酶的纯度和纯度是决定木聚糖酶制造成本及其产品竞争力的重要因素。这类典型的生物技术产品的50.90%需要改进。我国木聚糖酶的研究相对滞后,目前还未见产业化生产木聚糖酶的报道。因此,开发具有高回收率,并能获得高纯度酶的大规模经济有效的生物分离纯化方法,将是推动我国木聚糖酶获得实际商业化应用的重要课题。 本文简要叙述了目前采用较多的木聚糖酶纯化技术,着重讨论了双水相体系(ATPS)和糖类结合域(CBM)的原理与方法,并就未来发展方向提出自己的观点。 1 木聚糖酶的纯化 微生物产木聚糖酶大部分是通过色谱法最终纯化。由于纯化在生产上的重要性,国际上不少生物技术公司在最近几十年里不断研制出新型的色谱纯化介质及对原有介质填料进行改进。使介质的性能(流速、载量、p H使用范围、化学稳定性、分辨率)大大改进,各种预装柱及高度自动化智能化的仪器的出现也使得纯化更加便捷,致使色谱法成为实验室纯化蛋白质最成熟的技术,也是国内绝大部分木聚糖酶最终纯化所用的方法。 木聚糖酶的纯化方案设计依赖于酶的来源、酶所在的位置及最终的所需的纯度。虽然也有不少一步纯化的报道,但大部分都要经过多步实现。一般步骤是粗酶预处理、粗酶沉淀、色谱分离。木聚糖酶纯化的早期步骤通常使用低分辨率、非专一性的粗分离纯化手段如硫酸铵盐析、超滤、透析等以达到浓缩、去大部分杂质和色素的目的;随后常用的色谱有离子交换、凝胶过滤、疏水色谱、亲和色谱和色谱聚焦。使用率最高的是离子交换和凝胶过滤,离子交换基团大多数是以弱离子交换基团DEAE、CM为主,其次是强离子SP、Q等,凝胶过滤主要色谱介质是葡聚糖和琼脂糖及其改良物。Sa Pereira P综述66种文献中的木聚糖酶纯化方案:通常需约2～5步的纯化步骤,酶活性回收在0.2～78%之间变动,回收率与步骤的数目成反比,真菌产木聚糖酶活性回收常较细菌的为低,且色谱技术是限制高的酶活回收的因素之一。 2 cbm卡洛伊木马和纯度 2.1 糖脂糖的结构和功能变化 传统的色谱虽然具有高的分辨率,但多步纯化耗时、回收率低且在大规模纯化上有其局限性。重组蛋白大量表达也需要高效、简便的纯化方法,使得在过去的二十年里许多专一吸附的亲和纯化被提出以尝试取代多步的色谱技术。多肽融合标签是目前在实验室广泛用于重组蛋白纯化的一个有用地亲和纯化工具。多肽融合标签可以有选择性地结合到一个固定在合适基质上的互补配基上,目标蛋白通过基工程和蛋白工程与多肽标签结合成融合蛋白,此融合蛋白经一步亲和层析可得相当高的纯化。江正强薛业敏等用多组氨酸作为标签经过含镍螯合金属亲和色谱纯化木聚糖酶。然而,标签受体与基质交联时复杂的化学修饰、基质循环利用的有限性、高花费在大规模商业上的可行性等因素使得研究者寻求更合适的标签开辟其它新的纯化途径,CBM的应用便是一例。 糖类结合域(carbohydrate-binding module,CBM)存在于许多糖苷水解酶包括木聚糖酶中,是结构和功能上独立的的一个非催化的功能区域。许多聚糖水解酶常包含着一个催化区域和通过连接序列相连的一到多个的CBM。第一个被鉴定的CBM是结合晶体纤维素的,因此定义为纤维素结合域(cellulose-binding domain,CBD)。研究揭示不同的CBM有着不同的配基专一性及不同的结合位点,可结合到包括甘露聚糖、葡甘露聚糖、木聚糖、葡聚糖、单链纤维素、晶体纤维素、非晶体纤维素等糖类上。CBMs有选择的配基结合为其发展亲和纯化提供了有利的条件。来自Streptomyces olivaceoviridis木聚糖酶C-端的CBM 13,带有三个亚结构域(submodain)α、β、γ,每一个亚结构域上有单糖或二糖的结合点,α亚结构域对乳糖有较强的结合能力,乳糖化-琼脂糖亲和色谱一步纯化此木聚糖酶到单一组分。 一般认为这些功能区域即使彼此分开仍能执行其功能,因此许多功能CBM通过基因操纵技术进行独立地表达,用来分析其结构和生化性质。Mangala SL等的研究表明把从Clostridium stercorarium木聚糖酶分离的CBM通过蛋白工程结合到无CBM的Bacillus halodurans碱性木聚糖酶上并不影响原有酶对可溶性糖活力及和PH性质,却使之增加了对燕麦木聚糖的亲和力和活性,可溶性糖可使它解吸。Beatriz Rodriguez等的研究也证明来自Staphylococcusaureus的蛋白A活性并不受与CBM结合的影响。具有这种特点的CBM对于用它来作为一种亲和标签是有用的。蛋白酶酶切下的CBM,通过蛋白质工程与待分离蛋白融合形成融合蛋白,或基因工程构建含CBM标签的重组蛋白,在不影响原有酶活性情况下亲和色谱分离目的蛋白。Mojgan Kavoosi等利用T.marit