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棉花ghzfp1锌指蛋白基因的克隆及功能分析 钙指蛋白是生物中广泛存在的一个蛋白质家族。20多年来，人们对磷指蛋白的结构和功能进行了大量研究，并证明了磷指蛋白参与了整个生物体生长发育的过程。目前发现的锡指蛋白有10多种，包括c1h2、2ch、c1c2、c3c、c3h4和lcc。其中，lcc-锌指蛋白包含三个半胱氨酸和一个由氨基酸组成的锌指结构。到目前为止，已经在字母、植物、动物和人类中找到了这种锌指序列的存在，但对这种蛋白质的研究相对较少。根据最近的研究，预计南海棠的糖指数蛋白pei1、hu1和fes1参与了作物胚胎的形成、花的发育规则以及南海棠冬生动物特征的形成过程。甘露醇等。根据研究，由于第一阶段转移水稻的过度迁移，如gassypiumcinos基因的过渡性和抗病性得到了显著改善，但具体的作用机制尚不清楚。在本研究中，我们使用了祖母双杂交技术来分离和确定与ghsfp1（gossypiumbirrutan）相互作用的蛋白质，这为阐明戈斯提蛋白在植物抗逆性中的抗逆性机制提供了重要线索。 1 材料和方法 1.1 实验载体和试剂 棉花(Gossypium hirsutum)为中棉所19号,由中国农业科学院棉花所提供.本生烟(Nicotiana benthamiana)为本实验室保存.大肠杆菌DH5α、农杆菌GV3101、载体pBI-GhZFP1、HAP-5-pSPYCE-35S、pSPYNE-35S、pSPYCE-35S、bZIP63-pSPYNE-35S和bZIP63-pSPYCE-35S为本实验室保存,克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司,诱饵表达载体pGBKT7、pGADT7、酵母菌株AH109、Y187购自Clontech公司.酵母双杂交试剂盒BD MatchmakerTMLibrary ConstructionScreening Kits、酵母培养和转化试剂购自Clontech公司.mRNA分离试剂盒购自Qiagen公司.酵母质粒提取试剂盒(DP112-02)购自TIANGEN公司.DNA重组所用各种酶、DNA marker、胶回收纯化试剂盒、LB培养基胰化蛋白胨和酵母提取物购自TaKaRa公司,引物合成和测序由上海生物工程公司完成. 1.2 ctcgt-ccac 以质粒pBI-GhZFP1为模板,设计一系列特异性引物.引物1:GAATTCATGACCACTGTTTATGAC CC;引物2:CTGCAGCATCAAGAGCTCATTAAC-CCAC;引物3:CTGCAGCCTTGGTGTTCTTTGCTG GTGT;引物4:GAATTCAAGAACTATAACCATTGCT-GC;引物5:CTGCAGCTACATCAAGAGCTC ATTA-AC;分别用引物1-2,1-3,4-5进行编码GhZFP1全长、N端1-237氨基酸区域(m1)及C端238-339氨基酸区域(m2)的PCR扩增,连到pMD18-T克隆载体,再用Eco RⅠ和PstⅠ酶切位点进行酶切,定向亚克隆到酵母载体pGBKT7中,经酶切和测序验证. 1.3 分离培养4个知识品种的半乳糖苷酶活性检测 采用LiAc转化法分别将载体pGBKT7-Lam,pGBKT7-53,pGBKT7-GhZFP1,pGBKT7-m1,pGBKT7-m2及空载体pGBKT7转化酵母菌Y187和AH109.将转化的菌体分别涂布相应SD/-His/Trp/X-α-Gal或SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal平板,30℃培养1周,观察菌落生长情况,对其进行β-半乳糖苷酶活性检测.将转化pGBKT7-m1和空载体pGBKT7酵母细胞分别在SD/-Trp/Kan(20μg/ml)液体培养基中培养16-24 h,测定培养液的A600,进行诱饵蛋白的毒性检测. 1.4 菌株的筛选和序列分析 按CLONTECH公司酵母双杂交操作手册进行.首先构建盐胁迫诱导棉花叶片cDNA文库,之后将其转化到酵母菌Y187,再将pGBKT7-m1重组质粒转化到酵母菌AH109,利用Mating法筛选与GhZFP1相互作用蛋白质,并按照操作要求测定杂交效率和杂交克隆数以确保筛选文库规模.之后将生长的转化子进行1轮SD/-Leu/-Trp/-His培养皿和2轮SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal培养皿筛选,再挑取生长良好、深蓝色克隆提取酵母质粒并转化大肠杆菌DH5α.然后采用菌落PCR方法进行初筛,再用酶切方法排除相同克隆.将筛选出的每个cDNA融合质粒分别与pGBKT7-m1共转化入酵母AH109株进行回转验证,最后选取呈现明显蓝色的阳性克隆质粒用T7引物直接进行核苷酸序列测定,利用GenBank的数据库资源,用BLAST进行序列分析. 1.5 速度型pp-5和bcip33s的检