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植物重要农艺性状功能基因分离的研究 近年来，现代生物科学技术的快速发展使其应用更加广泛。为了研究疾病、寿命等人们关注的基因以及人类基因组计划的实施完成不断开发出许多新技术,逐渐应用于动物上,继而应用到植物中。许多模式动植物的研究也积累了大量的信息和技术。基因分离一直是生物技术研究的一个中心,分离基因和分子辅助育种可以大大缩短育种进程,对指导生产实践具有特别重要的意义。 分离基因的方法是在基因一个或几个特性基础上获得的。基因的特性可从中心法则中得到启示。依据基因的座位、转录和转译,基因的特性可以分为基因的序列(DNA),基因的转录产物——mRNA,基因的转译产物——蛋白质(protein),基因的功能和基因在基因组中的位置。根据这些特性将植物基因分离的方法分为以下几类,见表1。 1 基于生物活性的pcr扩增 如果所要获得的基因在其它植物上已经分离,序列已知,则可以采取以下两种方法分离研究植物上的相关基因:一是基因序列同源克隆法。根据发表的序列设计引物,以基因组DNA或mRNA反转录的cDNA 为模板进行PCR扩增。如果得到的只是基因部分序列,可以将其克隆至载体,作为探针筛选cDNA文库和基因组(gDNA)文库获得全长基因或用RACE得到全长基因。二是用作探针直接筛库。若能得到其它植物已分离的相关基因,则可以直接用作探针筛选cDNA文库和基因组(gDNA)文库,获得研究植物里的基因。 人类基因组计划的实施使大规模测序有了可能,相继各模式生物的测序工作也已经完成或展开。当各作物全基因组测序完成后,可以利用比较基因组学方法快速鉴定、分离感兴趣的基因。 2 pcr检测基因结果的表达 高等真核生物约含有10万个基因,在一定的发育阶段、在某一类型的细胞中,只有15%的基因表达,产生大约15000个基因。这种在生物个体发育的不同阶段、或在不同的组织器官中发生的不同基因按一定时间和空间有序表达的方式称为基因的差别表达(differential expressing)。这是基因表达的特点,也是分离克隆目的基因的前提。基于基因表达特点的分离方法有如下几个: 2.1 差示筛选 差示筛选又称差别筛选、示差筛选,是从检测样品(含有表达目的基因)和对照样品(不含有表达目的基因)里分别提取total RNA,分离mRNA,经反转录制成cDNA探针。用含有表达目的基因的cDNA文库铺平板,每个平板连续转两套膜,要尽量保证两张膜的一致性。用两种探针各与一张膜杂交,放射自显影。比较两张X光片相同位置的杂交印斑,用对照样品cDNA作探针杂交的X光片中没有而在检测样品cDNA作探针杂交的X光片中有的印斑,可对照X光片从原平板挑出菌落进行鉴定是否含有目的基因。这种方法灵敏度低,对于高丰度的mRNA是一种有效方法,低丰度的mRNA则难以检测到。 2.2 扣除杂交 1966年Bautz等基于差示筛选的局限性,提出扣除杂交,后又有多个实验室改进了这项技术。扣除杂交是从来源相似而功能有异的两种样品获得mRNA,含有目的基因的样品称为检测方(tester),不含有目的基因的样品称为驱动方(driver)。将检测方mRNA反转录为cDNA,与过量(10倍于检测方)的驱动方mRNA进行杂交,经过柱或其他方法去掉双链杂合体,富集目的基因,构建扣除cDNA 文库,筛选目的基因。此法操作较难,重复性差,敏感度低。 2.3 mRNA差别显示 1992年Peng等提出DDRT-PCR。根据真核生物3′端poly(A)尾的特点设计锚定引物T11MN 12种,锚定引物可以将扩增产物分为12个亚组(M可为A、G、C三种碱基,N可为A、T、G、C四种碱基);另一端为10nt的随机引物20种(随机引物因序列不同而在离poly(A)最近的一端配对)。这些引物组合扩增后约能得到20000条带,可大致包括某一发育阶段的全部基因,扩增后利用测序胶分离,放射自显影或银染获得结果,并对差异片段回收、克隆、测序以确定其是否为目的基因。这种方法由于介入PCR技术,使低丰度mRNA的检测成为可能。但假阳性率高达70%,扩增条带分子长度较短,110~450bp。 2.4 代表性差示分析(RDA) 1993年,Lisitsyn等在消减杂交基础上提出了RDA技术。Hubank等对方法进一步完善。该方法是用识别四核苷酸位点的限制性内切酶分别切割检测方(tester)和驱动方(driver)的DNA或cDNA,各连上接头Ⅰ,并以接头Ⅰ为引物分别进行PCR扩增。扩增后将接头Ⅰ切除,在检测方片段末端连接上接头Ⅱ。将检测方与过量的驱动方的DNA或cDNA混合杂交,退火时形成三种杂合体tester/tester、tester/driver、driver/driver。以接头Ⅱ为引物进行二次扩增,tester/tester都连有接头,与引