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13-1i抗vegfmcab的制备及免疫活性研究 肿瘤血管生长与肿瘤提供血液和氧气。这是肿瘤生长、浸润和转移的重要组成部分。血管内皮生长因子/血管通透性因子 (Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor, VEGF/VPF) 是血管生成过程中的中心环节。VEGF以旁分泌方式作用于血管内皮细胞, 促进血管内皮细胞增殖、迁徙, 诱导新生血管的形成。以抗血管生成进行实体瘤的诊断与治疗是一种肿瘤诊治新思路。应用抗VEGF McAb针对瘤体内VEGF诱导的血管生成进行肿瘤免疫治疗, 国内外多有报道。但以放射性核素标记抗VEGF McAb作为显像剂进行肿瘤放射免疫显像诊断的相关研究尚未见报道。本实验应用核医学技术, 在体外合成131I-抗-VEGF McAb (sc-7269) 并鉴定其免疫学活性, 探讨将其应用于放射免疫显像 (Radioimmunoimaging, RII) 的可行性。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 细胞 T24细胞为浸润性人膀胱癌细胞系, 胞浆内高水平表达VEGF。人脐静脉血管内皮细胞。 1.1.2 不含氟酸钠nf 鼠抗人、鼠VEGF McAb (sc-7269) :Santa Cruz公司;Na131I:中国原子能研究院 (无还原剂、无载体) ;Iodogen (四氯二苯基甘脲) :美国Sigma公司;Sephadex G-50:瑞士Pharmacia公司。 1.1.3 主要设备 CO2培养箱:美国Shel、Lab公司生产;FH463A自动定标器:北京核仪器厂;RM905放射性活度计:中国计量科学研究所。 1.2 方法 1.2.1 产第1i-sc-7269 1.2.1. 膜法分离标记物的制备 采用Iodogen法标记sc-7269:将100 μg Iodogen溶解于100 μl氯仿溶液中制成Iodogen溶液;取15 μl Iodogen溶液置于乙烯子弹头离心管中, 旋转蒸发后在试管底部内壁形成一层均匀的氯甘脲膜;在涂有Iodogen 15.0 μg 的试管中依次加入0.5 mol/L、pH 7.6的磷酸盐缓冲液100 μl, sc-7269 35.0 μg, Na131I 92.5 MBq, 充分混匀后在室温下反应15 min, 其间温和地震荡数次, 加入1% KI 50.0 μl终止反应。反应液滴加于预先经PBS (10 mmol/L、pH 7.4) 平衡、2%牛血清白蛋白液淋洗饱和的Sephadex G-50层析柱上, 用10 mmol/L、 pH 7.4的PBS洗脱层析柱, 通过自动部分收集器收集洗脱液, 流速每管1.0 ml/3 min, 共收集60管, 每管取10.0 μl, 在FH463A自动定标器上分别进行放射性测量 (cpm值) , 以试管编号为横坐标, 对应各管的cpm值为纵坐标, 绘制洗脱曲线。标记产物的标记率、放射浓度按下列公式计算: 标记物的纸层析:取分离纯化后标记产物 (131I-sc-7269) 5.0 μl, 在层析滤纸距一端0.5 cm处中央点样 (新华3#滤纸, 长 20 cm, 宽3.0 cm) , 点样时要求点样范围直径不能超过0.5 cm, 用正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶5的展开剂进行上行层析15.0 cm左右, 层析时间约为3 h, 层析完毕后将层析滤纸于室温下晾干, 自原点起将层析滤纸剪成长各0.5 cm的30张纸片。将纸片按顺序分别置于FH463A自动定标器上测放射性计数, 绘制纸片编号—计数曲线。 1.2.1. 标记产物的放射性测定 标记产物131I-sc-7269放射化学纯度的测定:三氯醋酸法从蛋白峰 (标记产物131I-sc-7269) 收集液中, 取10.0 μl标记产物于试管内, 加入100 μl 2%牛血清白蛋白液充分混匀, 加入15%三氯醋酸液三滴混匀, 立即测总放射性 (A) , 离心1 500 r/min×5 min后弃上清液, 测沉淀放射性 (B) , 按下列公式计算标记产物的放射化学纯度及游离碘率: 131I-sc-7269比活度的测定:蛋白峰收集液应用RM905放射性活度计测量标记产物的活度, 根据投入的抗体的总化学量计算比活度或按下列公式计算: 蛋白峰收集液过滤除菌后用于下一步实验。 1.2.2 细胞内皮细胞的提取 以脐静脉血管内皮细胞作为对照进行131I-sc-7269的免疫活性鉴定。常规培养的T24细胞、脐静脉血管内皮细胞, 用DMEM完全培养液制备细胞悬液, 调至细胞浓度1×106/ml, 两种细胞各分装入6孔培养板中的3孔 (每孔1×106/ml) 。每组细胞中分别加入131I-sc-7269 (105 cpm) , 摇匀后常规培养,