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赭曲霉对16,17-环氧黄体酮的c 16，17环黄酮（16，17二醇，ep），被称为16c、17c-环黄酮-4-3、20-二醇和肥沃的氧化氧化物。它是白色的结晶粉末，没有味道，轻微溶于乙醇、甲醇和甲板。利用微生物进行C11α-羟基化是甾体生物转化中的一个重要反应,得到的C11α-羟基化产物是合成地塞米松、强的松龙等药物的重要中间体。据文献报道,应用于16α,17α-环氧黄体酮C11α-羟基化的微生物生产菌种主要有黑根霉(Rhizopus nigricans)、雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)和绿僵菌(Metarhiziumsp.)等,产率一般在45%～75%之间,对发酵条件及操作要求较高且副产物种类较多。 作者就赭曲霉(Aspergillus ochraceus)405转化16α,17α-环氧黄体酮的C11α-羟基化工艺进行了研究,并将羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)应用于该反应中,提高了转化率。 1 实验 1.1 其它试剂 16α,17α-环氧黄体酮,天津津津药业有限公司;其它试剂均为市售分析纯。 Agilent1100型高效液相色谱仪,美国安捷伦公司;HP-β-CD(取代度6.52),西安德立生物化工有限公司。 1.2 微生物制剂研究 菌种:赭曲霉(Aspergillus ochraceus)405,天津科技大学微生物制药研究室保藏。 斜面培养基(g·L-1):土豆200,葡萄糖20,琼脂20,酵母膏1,pH值自然。 转化培养基(g·L-1):葡萄糖30,玉米浆40,蚕蛹粉2,硫酸铵1.5,pH值6.4。 1.31 角瓶培养法 将斜面菌种于28℃ 培养7 d,无菌水洗下孢子,制成浓度为5×107个·mL-1的孢子溶液,取一定量接种于50 mL/250 mL三角瓶发酵培养基中,28℃、200 r·min-1振荡培养28 h,加入10 g·L-1EP,继续转化48 h。 1.4 hp-1cd添加方法 称取与EP不同摩尔比的HP-β-CD,用紫外线灭菌30 min后分别加入到发酵液中。 1.5 摇床及振荡20d 配制一系列浓度的 HP-β-CD 溶液,各取10 mL于具塞试管,加过量的EP,在摇床上28℃、200 r·min-1恒温振荡24 h。取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤,用高效液相色谱法测定其浓度,以EP浓度为纵坐标、HP-β-CD浓度为横坐标,绘制相溶解度图。 1.6 高效液相色谱法检测高效液相条件 取2 mL发酵液加入4 mL乙酸乙酯进行萃取,离心,精确取上清液0.1 mL于1.5 mL的小离心管中,自然风干后加1 mL流动相,12 000 r·min-1离心10 min。然后用高效液相色谱仪检测,色谱柱为Phenomenex C18(5 μm,250 mm×4.6 mm);流动相为甲醇∶水=80∶20(体积比);流速1 mL·min-1;检测波长240 nm;柱温30℃;进样量20 μL;外标法检测。转化率依下式计算: 转化率=X×d×V×MEPmEP×M产物×100%=X×d×V×ΜEΡmEΡ×Μ产物×100% 式中:X为液相测得的产物浓度,mg·L-1;d为稀释倍数;V为发酵液的体积,L;mEP为V体积内底物的质量,mg;MEP与M产物分别为底物与产物的摩尔质量,g·mol-1。 2 结果与讨论 2.1 发酵体系的传质 摇床转速对转化体系的影响主要包括溶氧和剪切力两方面,提高转速可以强化底物和氧气在菌体发酵体系中的传质,促进酶与底物的充分接触。但随着摇床转速的提高,剪切力也相应增大,会将菌丝打碎,反而不利于细胞的生长。考察摇床转速对转化率的影响,结果见图1。 由图1可知,当转速为200 r·min-1时,赭曲霉菌球大小一致,转化率最高,最适宜转化反应的进行。 2.2 -羟基化反应的影响 配制浓度为5×107个·mL-1的赭曲霉孢子悬浮液,以不同接种量接种,考察接种量对C11α-羟基化反应的影响,结果见表1。 由表1可知,接种量较小,菌球大而数量少;随接种量增大,摇瓶内菌球变小、数量增加,发酵液逐渐呈粥状。转化率也随着接种量和摇瓶中菌球形态的不同而不同,接种量为2.0%时转化率最高达72.6%,此时,摇瓶中菌球呈小米状。 2.3 制备成菌体实验方法 考察了不同底物投料方式对转化率的影响,结果见图2。(1)有机溶剂助溶法:分别用甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇、DMF、DMSO溶解EP,所有溶剂均按照4%的比例添加,然后超声振荡处理5 min以加速EP在溶剂中的分散,加入到已培养好的菌体中进行转化实验。(2)吐温80乳化法:用吐温80溶液高温乳化EP后,超声振荡5 min,然后加入到已培养好的菌体中进行转化实验。(3)干粉投料法:将EP紫外灭菌后直接加入到已培养好的菌体中进行转化实验