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oxldl-ab的i标记及体外稳定性和活性评价 动脉硬化（as）是导致各种心脑血管疾病的主要原因。它是在某些异常情况下, 血管内皮发生损伤, 刺激巨噬细胞释放炎症因子, 血浆中的低密度脂蛋白(Lowdensity Lipoprotein, LDL) 载带胆固醇经过损伤处时, 被炎症因子等氧化修饰成氧化低密度脂蛋白(Oxidized Lowdensity Lipoprotein, OxLDL) , 巨噬细胞通过清道夫途径识别并吞噬OxLDL, 并吸收其载带的胆固醇而膨胀形成泡沫细胞, 并渐渐积累形成粥样斑块;OxLDL是AS全病程中重要的标志物, 并且与高血压等疾病密切相关。OxLDL作为抗原刺激机体产生的自身抗体是氧化低密度脂蛋白单克隆抗体(Antioxidized Lowdensity Lipoprotein Monoclonal Antibody, OxLDL-Ab) 。根据125I标记的单克隆抗体与抗原物质定量反应, 可以使体内存在的抗原物质得以常规化检测, 这对受检者的临床诊断和治疗有实际意义。 目前, 国外已有OxLDL-Ab的酶联免疫试剂盒出售, 国内已有OxLDL半定量试纸专利, 但尚无OxLDL-Ab放免试剂盒的研究报道。鉴于放免试剂盒具有结果可靠、简便易行、成本低廉并具有高灵敏度、高特异性等优点, 本研究拟采用放射性核素125I标记抗OxLDL-Ab, 评价125I-OxLDL-Ab与OxLDL结合的活性, 为抗OxLDL-Ab用于AS体外诊断放免试剂盒的研究提供实验基础。 1 实验部分 1.1 聚天平pd-10柱型 GAMMAC12 γ 计数器:美国DPC公司产品;RM-905a型活度计:中国计量科学研究院产品;AR2130型电子天平:美国OHAUS公司产品;单道可调移液器:美国Eppendorf公司产品; PD-10柱:瑞典Amersham Bioscience公司产品;Whatman No.1试纸:英国Whatman公司产品。 1.2 小鼠钥孔虫基因 OxLDL-Ab:1.228 g/L, 成都华神生物技术有限责任公司提供;牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumin, BSA) :北京博奥森生物技术有限公司产品;Na125I溶液:放射性浓度为13 TBq/L, 美国PerkinElmer Life Science公司产品;小鼠钥孔虫戚血蓝蛋白 (Mouse Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH) :Sigma Aldrich公司产品。其它化学试剂均为分析纯, 购自北京化学试剂公司。 1.3 标记的纯化和鉴定 采用Iodogen法进行标记。将81 μL OxLDL-Ab 的PBS溶液 (0.2 mol/L, pH 7.4, 含40 μg OxLDL-Ab) 置于Iodogen管中, 加入9.25 MBq Na125I溶液, 用0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸缓冲液 (PB) 调反应体积至200 μL, 振摇反应8 min, 移出反应液, 停止反应。 用PD-10柱层析法对标记液进行纯化。以0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液为淋洗液, 流速控制在每分钟约6滴, 按每管0.2 mL收集洗脱液, 并测量放射性活度。 采用纸色谱法测定125I-OxLDL-Ab的标记率和放化纯度。分别将纯化前的反应液和纯化后的产物用Whatman No.1试纸测定, 以V(甲醇) ∶V(水) =85∶15溶液为展开剂。 1.41 盐水与人血清三种生物体系放化纯度的测定 将400 μL放化纯度为96%、放射性比活度为24 TBq/g的125I-OxLDL-Ab, 分别置于生理盐水、含2%BSA的生理盐水和人血清3种体系, 各体系一式3份, 分别置于4、10和37 ℃存放, 分别于放置后1、2、18 h和1、2、3、4、6、7 d取样, 用纸色谱法测其放化纯度。 1.5 标准样的制备 125I-OxLDL-Ab与其抗原KLH的结合实验采用96孔板法。用100 μL 0.05 g/L KLH包被液包被96孔板, 于4 ℃放置过夜, 弃去孔内液体并用200 μL含0.1%BSA的PBS (pH 7.4, 0.01 mol/L) 洗涤3次;每孔加入200 μL含2%BSA的PBS 封闭, 37 ℃孵育1 h, 使没有结合的多余位点完全封闭, 如上方法洗涤;将125I-OxLDL-Ab (96%, 41.4 PBq/mol) 按倍比稀释法配成系列浓度, 分别与包被的抗原结合, 反应平衡后, 如上方法洗涤。分别测各孔γ计数, 为总结合 (TB) ;测量标准样的放射性计数。非特异性结合 (NSB) 每孔加入500 ng (100 μL) OxLDL-Ab, 置于37 ℃下孵育1 h后洗涤