3.2+基因工程的基本操作程序（第三课时）.pptxVIP

第3章 基因工程工程第2节 基因工程的基本操作程序（第三课时）DNA片段的扩增及电泳鉴定 目标明确010203针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。（科学探究）结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。（科学思维）学习目标运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等（生命观念） 目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞第一步第二步第三步第四步目的基因的检测与鉴定核心温故知新：基因工程的基本程序问题1: 上述操作程序中涉及PCR技术的步骤有？ 补充第一步：目的基因的筛选与获取——获取某种生物体内的全部DNA适当的不同限制酶切割与质粒连接受体菌导入受体菌 实验原理材料用具实验步骤DNA体外扩增的原理DNA片段电泳鉴定原理 DNA片段的扩增及电泳鉴定探究.实验 DNA片段的扩增及电泳鉴定探究.实验一、实验原理（一）DNA体外扩增的原理：PCR仪①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理；PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 DNA片段的扩增及电泳鉴定探究.实验一、实验原理（二）DNA片段电泳鉴定原理：电泳鉴定原理DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。琼脂糖凝胶电泳DNA分子电泳 DNA片段的扩增及电泳鉴定探究.实验三、实验步骤（二）DNA片段的电泳鉴定： DNA片段的扩增及电泳鉴定探究.实验一、实验原理（二）DNA片段电泳鉴定原理： DNA片段的扩增及电泳鉴定探究.实验二、材料用具（一）仪器：PCR仪微量离心管电泳装置微量移液器自动控温，实现DNA的扩增实际上是进行PCR反应的场所用于向微量离心管转移PCR配方中的液体包括电泳仪、电泳槽等 DNA片段的扩增及电泳鉴定探究.实验二、材料用具（二）试剂：（1）无菌水、琼脂糖；（2）电泳缓冲液（TAE或TBE）；（3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）；（4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。（5）PCR反应体系的配方材料用量10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）1～2U模板DNA （用量为1pg-1μg）5～10μL DNA片段的扩增及电泳鉴定探究.实验三、实验步骤（一）DNA片段的扩增：移液离心扩增用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃,5min30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min//可根据目的片段长度适当调整延伸时间预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 DNA片段的扩增及电泳鉴定探究.实验三、实验步骤（一）DNA片段的扩增： 配制琼脂糖溶液根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀制备凝胶将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜加样将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物电泳接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳观察记录取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 DNA片段的扩增及电泳鉴定探究.实验三、实验步骤（二）DNA片段的电泳鉴定： DNA片段的扩增及电泳鉴定探究.实验三、实验步骤（二）DNA片段的电泳鉴定： DNA片段的扩增及