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基于rapd技术的18个三色堇自交系的遗传多样性分析 三色堇，又名蝴蝶花和鬼脸花，是早春的一种重要花卉。目前三色堇品种十分繁多,各品种类群间的遗传关系十分复杂,要进一步培育新品种,弄清各品种类群间的遗传关系是十分必要的。传统上常通过外部形态特征来研究品种间的遗传关系,但形态特征易受环境的影响而使结果出现偏差。RAPD (random amplified polymorphic DNA),即随机扩增多态性DNA技术,能从DNA水平上分析不同个体之间的差异,不受栽培环境等因素的影响,目前已在园林植物的亲缘关系研究方面有了一些应用。在堇菜属RAPD研究方面,Lee用RAPD技术标记了韩国堇菜属的3个亚属,Oh曾用RAPD技术来区分堇菜属中的不同种;但用RAPD研究不同三色堇品种或自交系间的遗传关系则尚未见报道。 基于分子标记的遗传距离用于杂种优势的预测在园艺作物上已有了较多的应用。本试验拟采用RAPD技术,研究18个三色堇自交系的遗传关系,为杂交新品种的培育提供必要的遗传资料。同时研究三色堇RAPD遗传距离与多个观赏性状的杂种优势、性状值和配合力之间的相关关系,以期为三色堇杂种优势预测提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 交系的主要特点 RAPD扩增试验用的三色堇(Viola wittrockiana) 18份自交系均由本实验室2000~2004年自交得到,其编号、来源与主要观赏特点见表1。田间试验选用其中5个性状已比较稳定的F4或F5代自交系3、8、9、12、18,来源分别是欧洲(3、8、9)、中国(12)与美国(18),具有一定的代表性。 1.2 调查与统计方法 采用Griffing双列杂交方法2进行杂交试验,自交系于2004年3月杂交得到F1代种子,2004年9月将亲本与F1播种于穴盘,10月中旬定植于直径17 cm的瓦盆,随机区组设计,3次重复。2005年3月16日(盛花期)进行10个性状的测量与统计。这10个性状分别是:花径,以花心为中心,分别测花的横径与纵径,取二者平均值;花数,每植株所具有已开放的花朵总数;花葶长,从花葶基部到花朵基部的长度;分枝数,每植株所具有的长度大于5 cm的分枝总数;株高,自植株基部至顶端的自然高度;株幅,植株最宽幅度与最窄幅度的平均值;高/幅,即株高与株幅之比;叶型指数,叶长与叶宽之比;开花指数,由公式:花数×(花径/株幅)2计算而来;叶面积,由椭圆叶片计算公式:(1/4)π(叶长×叶宽)计算而来。 1.3 pcr反应动力学 三色堇总DNA提取参照项艳等的方法。RAPD反应在PTC-100基因扩增仪上进行。所用引物为Operon、Sangon及Bioasia公司产品,均为10碱基随机引物。扩增反应体系为:10 mmol·L-1Tris-HCl (pH 9.0),50 mmol·L-1KCl,每种0.2 mmol·L-1dNTP,2.5 mmol·L-1MgCl2,0.4 μmol·L-1引物,40 ng 模板DNA,1.2 UTaqDNA聚合酶(大连宝生),反应体积为20 μL。扩增反应程序为:94℃预变性2 min,然后按程序:94℃ 30 s,36℃ 30s,72℃ 1.5 min 扩增40个循环,最后在72℃延伸10 min。 扩增产物在1.4% 琼脂糖凝胶中电泳1.5~2.0 h,电泳液为1×TAE,在凝胶中加入0.5 μg·mL-1EB。电泳后在紫外灯下观察照相。 1.4 rapd扩增回复突变试验pcr RAPD扩增谱带按有(1)和无(0)记录,根据Nei相似系数计算任意两样品间的相似系数F= 2NXY/(NX+NY),NXY为品种X 和Y经RAPD 扩增反应分子量相同的谱带总和,NX、NY分别代表品种X、品种Y经RAPD扩增反应的谱带总数,遗传距离GD=1-F,再根据遗传距离利用UPGMA法构建遗传聚类图, bootstrap自展500次,计算运用FREETREE软件进行。 双列杂交资料按刘来福等的方法进行方差分析,并估算一般配合力与特殊配合力效应值。杂种优势根据下列公式计算:中亲优势HP=F1/MP-1;超亲优势MP=F1/BP-1。其中F1为F1代杂种性状值,MP为中亲值,且MP=(P1+P2)/2,P1、P2分别为亲本1与2的性状值,BP为优亲值。用SAS软件计算RAPD遗传距离与杂种表型值、杂种优势和特殊配合力的相关系数。 2 结果与分析 2.1 rapd扩增图谱的建立及聚类分析 21个引物共扩增出167条带,多态性带127条,多态性比例为76.05%,说明不同的自交系间有丰富的遗传多样性。引物与基因组DNA随机结合,最多扩增出13条带,最少有2条带,21个引物平均扩增的条带数为7.95,扩增产物的分子量集中在0.2~2.0 kb之间。图1是引物M14的RAPD扩增图谱