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型登革病毒在kmb17上的适应性培养及增殖动态研究 病毒位于真菌病毒科，属于黄毒科黄色病毒科。它主要通过埃及蚊和白纹蚊传播，导致真菌病毒（df）、发病率高、死亡率高的登甲出血热（dhf），以及登甲休克综合征（sds）。病毒在蚊体内以及白纹伊蚊传代细胞(C6/36细胞)、猴肾、地鼠肾原代和传代细胞中能增殖,并产生明显的细胞病变。病人及隐性感染者是本病的主要传染源,而丛林中的灵长类是维护病毒在自然界循环的动物宿主。迄今为止全球仍没有获准上市的登革病毒疫苗,目前最有潜力的传统减毒活疫苗候选株是由泰国沃特瑞德研究所(WRAIR)研发的以犬肾细胞和恒河猴胚肺细胞为基质的疫苗,Vero细胞也被认为是疫苗开发的候选基质,以人源性细胞制备的登革疫苗候选株还未见报道。因此研究登革病毒在人源性细胞上的适应性对于登革病毒疫苗的研发具有重要意义。 人胚肺二倍体细胞株KMB17由医学生物学研究所建立并拥有自主知识产权,作为人源性细胞基质生产人用疫苗时,引入的外源因子较少,比动物来源的细胞基质具有更好的安全性,且能实现大规模疫苗生产,已经成功应用于甲肝疫苗、脊髓灰质炎疫苗的生产。本研究将Ⅲ型登革病毒中国株D9964在人胚肺二倍体细胞KMB17上培养适应,并对其生物学特性和增殖动力学进行研究,成功筛选并纯化出能在KMB17细胞中稳定增殖并具有良好抗原性的适应株。此研究将打破登革病毒宿主细胞局限性,为登革病毒疫苗的研发开拓新的思路,为研发我国拥有自主知识产权的登革病毒灭活疫苗及减毒活疫苗奠定基础。 材料和方法 1 东省疾病预防控制中心 Ⅲ型登革病毒中国株D9964为广东省疾病预防控制中心惠赠,KMB17细胞(第21代)由中国医学科学院医学生物学研究所分子流行病室保存。 2 抗血清、igg和型登革病毒人源 MEM培养基由该所生物制品四室提供;新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司;Ⅲ型登革病毒人源抗血清购自英国国家生物制品检定所(NIBSC);FITC 标记的兔抗人IgG 购自Sigma公司;病毒RNA/DNA抽提试剂盒购自杭州爱思进生物技术有限公司;Real Time-PCR 试剂盒购自大连宝生物公司。 3 方法 3.1 rt-pcr扩增 根据卫生部发行的《登革热诊断标准》中所述的“RT-PCR技术检测登革病毒RNA及型别鉴定”方法,合成登革病毒通用引物(D1和D2)和Ⅲ型登革病毒型特异性引物(D1和TS4)。以收获10代的病毒培养物基因组RNA为模板,通过RT-PCR对Ⅲ型登革病毒特异性基因进行扩增,扩增片段大小分别为511 bp和393 bp。引物序列D1:5′-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3′,D2:5′-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC -3′TS3: 5′-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3′。反应条件:50℃30 min合成cDNA;94℃预变性2 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,共35个循环;最后72℃延伸7 min。 3.2 细胞增殖检测 以100 μlⅢ型登革病毒中国株D9964接种长至单层、生长状态良好的C6/36细胞,37℃、5%CO2条件下培养7~10d,待细胞病变达++++,收集细胞液,于4℃,3 000 r/ min 离心5 min后收获上清,-70℃保存。采用微量滴定法测定病毒滴度,将vero细胞按104个/孔接种于96孔细胞培养板,待细胞长成致密单层后,将病毒用含2%血清MEM培养基以10倍系列稀释,每个稀释度设4个复孔,每孔加入100 μl,并设细胞对照和未稀释病毒对照。于37℃、5%CO2条件下培养7d,记录细胞病变程度。按Reed-Muench公式计算病毒的感染性滴度。 3.3 细胞培养和增殖 将-70℃保存的登革病毒于37℃水浴5 min,用PBS将已铺满单层,生长状态良好的KMB17细胞洗涤1次,以4.0MOI的毒种进行适应性传代,加入含2%血清的MEM 维持液,于37℃、5%CO2培养7 d,镜下观察细胞病变(CPE)。培养7 d后收毒,反复冻融2次,再以同样方法接种下一代,直至细胞出现病变,CPE达++++,筛选出的能够在KMB17 细胞上增殖的毒株检测滴度并于-70℃保存。将筛选出的登革病毒以4.0MOI接种长至单层、状态良好的KMB17细胞,在5%血清浓度的MEM培养基中培养,连续传10 代。采用微量滴定法测定每代病毒液感染性滴度。 3.4 细胞培养和病毒的分离培养 利用KMB17细胞对选育出的Ⅲ型登革病毒D9964细胞适应株进行噬斑筛选纯化。弃去6 孔板中已生长成单层的KMB17细胞的培养液,用Hanks 液漂洗2 次。用不含血清的维持液将病毒稀释后以4.0MOI接种细胞,置37 ℃孵育4h,每隔15 min