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不同亚层葡聚糖在正常猪眼视网膜的分布 玻璃内药物注射液是一种常见的治疗方法。大药物（如血管内生长因子抗体、丙烯酸酯等）也越来越被使用，但对大药物在眼睛内代谢的研究很少。神经视网膜分为9个亚层,是与玻璃体接触面积最大的部分,大分子药物注射到玻璃体内后,很大一部分要向视网膜扩散,而已有文献关于视网膜不同亚层对大分子通透性差异的研究报道较少,因此,本研究使用与人眼视网膜解剖结构相近的猪眼视网膜和自行设计的通透实验装置对此进行研究。 1 材料和方法 1.1 视网膜的制备 从屠宰场获得新鲜尸体猪眼(处死后不超过3 h,温度低于10 ℃,取得后立即置于4 ℃冰箱,实验时间距处死不超过6 h)。将猪眼球从角膜缘后6 mm处环形切开,前段组织被剔除,轻柔地将玻璃体从视网膜表面分离。使用光滑的玻璃棒将视网膜从外壁分离后浸泡于RPMI 1640细胞培养液(包括5 958 mg·L-1HEPES,100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素,pH 7.4,天润善达公司,中国),将视网膜贴附于20～25 μm孔径无灰滤纸(No.541;Whatman,Maidstone,UK)。 1.2 荧光显微镜观察 Carboxyfluorescein(相对分子质量376 )和不同相对分子质量的FITC-dextran(绿色荧光标记的葡聚糖)被用于本实验,葡聚糖的相对分子质量分别为4 400、9 300、19 600、38 900、71 200和150 000(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。我们选择部分样品进行凝胶过滤层析来验证无游离的荧光集团FITC存在。1 h通透实验后,视网膜组织从装置上取下,包埋剂固定冷冻,冰冻切片机切片(CM1900;Leica,Wetzlar,德国),厚6 μm,荧光显微镜观察照相(DFC300 FX;莱卡,剑桥,UK)。随后,切片浸入体积分数为4%甲醛10 min,进行苏木素-伊红染色。 1.3 实验装置的密闭性 我们自行设计了体外通透实验装置(图1),材料为无磁性不锈钢,室间孔的直径为4 mm。首先,直径8 mm的视网膜(同滤纸贴附)放置于装置的底座中央(图1A),内界膜朝上或朝下,然后对准底座上的凹槽,上部小室(图1B)通过重力将视网膜片固定,使用氰基丙烯酸盐黏合剂封闭边缘。包含1 mmol·L-1Carboxyfluorescein和0.1 mmol·L-1FITC-dextran的RPMI 1640细胞培养液1 mL被加入上部小室,40 mL RPMI 1640细胞培养液被加入外部小室(图1C～E)。2个小室的液平面保持在同一水平。整个实验的环境温度为25 ℃,避免周围光线照射。为了验证这种方法的可行性和装置的密闭性,我们使用了防水塑料膜和尸体猪眼视网膜进行预实验。结果显示装置密闭,上部小室的液体不会通过联合部外渗。 2 常猪眼视网膜亚层分布 在FITC-dextrans溶液中没有检测到游离的荧光集团。内界膜面朝上时,经过1 h的通透实验,Carboxyfluorescein和不同相对分子质量的葡聚糖在正常猪眼视网膜的分布不同(图2)。荧光显微镜下,荧光标记分子密度最高的亚层亮度最大:内界膜面朝上,Carboxyfluorescein在视网膜的内核层和外核层聚集(图2A),内界膜面朝下时,分布相似(图2B);内界膜面朝上,相对分子质量为4 400葡聚糖在内核层聚集(图2C),相对分子质量为19 600葡聚糖被阻挡在内核层以前(图2E),相对分子质量为150 000葡聚糖被阻挡在内丛状层以前(图2G),内界膜面朝下,这3种相对分子质量不同的葡聚糖基本被阻挡在外核层以外(图2D、2F、2H)。 3 视网膜屏障和其它屏障 本实验的原理如下:如果FITC-葡聚糖分子足够小,能够自由通过全层视网膜,那么荧光标记分子的密度在视网膜的通透屏障层会最高,在荧光显微镜下观察的亮度最强。但是当FITC-葡聚糖分子较大,不能通过全层视网膜时,这些大分子将被阻挡在第一个通透屏障前,这个屏障在荧光显微镜下观察相对较暗。使用Carboxyfluorescein(相对分子质量376)进行通透实验发现内核层和外核层最亮,这表明内核层和外核层是通透的“瓶颈”。 相对分子质量为4 400的FITC-葡聚糖从视网膜内层向外层弥散时,内核层是最亮的,而外核层是暗的,这表明相对分子质量为4 400 FITC-葡聚糖,外核层是通透屏障而不是内核层。相对分子质量为9 300～71 200的FITC-葡聚糖从视网膜内层向外层弥散时,内核层不亮,而内核层以前的部分是亮的,这表明对于相对分子质量为9 300～71 200 FITC-葡聚糖而言,内核层是通透屏障,而内核层以前的内丛状层、神经纤维层、神经节细胞层和内界膜都不是。相对分子质量为