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常染色体隐性遗传almae综合征一例 目前，as综合征（as）的主要病因机制与肾基底膜（gbm）上型胶原c3、4或5链的突变有关。例如，col4a链编码的c5链遗传因素突变可导致x链显性遗传（约85%），而col4a3基因（或col4a4基因）的突变则导致正常染色体隐阳性as（约14%）和正常染色体显性as（约1%）。国外对ARAS患者COL4A3和COL4A4基因突变的报道较少,国内更无相关报道。本研究对一ARAS家系进行了COL4A3及CoL4A4基因突变分析。 对象和方法 一、 肾活检组织免疫荧光检查组 先证者,男性,28岁,听力下降14年,视力下降6年,发现血尿、蛋白尿2个月。尿红细胞80～100/HP,为肾小球源性血尿,24 h尿蛋白定量4.38 g。血浆白蛋白36.28 g/L,BUN 8.86 mmol/L,Scr 146μmol/L。血压150/100 0mmHg。双眼检查示右晶体前凸,左前囊下混浊。电测听检查为双耳中度神经性耳聋。肾活检组织光镜下21个肾小球中3个球性硬化,其余肾小球系膜细胞和基质轻至中度弥漫增生;肾小管上皮细胞重度空泡变性,灶状萎缩,肾间质多灶状淋巴和单核细胞浸润伴纤维化,伴泡沫细胞形成。电镜检查可见肾小球系膜细胞和基质轻度增生,GBM弥漫分层,撕裂状改变,伴节段性基底膜变薄,见图1。肾活检组织免疫荧光检查示Ⅳ型胶原α3及α4链为阴性,而α5(Ⅳ)链除包曼囊和部分远曲小管基底膜(TBM)阳性外,在GBM呈阴性。皮肤基底膜(EBM)Ⅳ型胶原α5链染色为弱阳性。见图2。根据临床表现、病理检查,该患者AS诊断明确,为本研究家系的先证者。 二、 绘制家谱系图 对先证者3代以内的亲属进行了家系调查,绘制家系谱图。调查内容包括年龄、性别、血压、是否水肿、视觉、听觉以及尿常规(试纸法)和肾功能检查。 三、 pcr和测序 1.基因组DNA提取:经家属同意采集家系各成员外周血样,应用盐析法提取外周血白细胞的基因组DNA。 2.基因扩增及DNA序列测定:参照文献选取Ⅳ型胶原COL4A3及COLA4基因各外显子(共98个)临近区域的内含子序列,分别设计上游和下游引物,引物由上海华诺公司合成。PCR扩增后取2μl扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增效果。PCR产物经PCR纯化试剂盒(天为时代)纯化后测序(上海华诺公司)。测序结果与人类基因组COL4A3和COL4A4基因序列比较并分析结果。 3.限制性内切酶图谱分析:对该家系20名成员COL4A3基因第42外显子PCR扩增产物用AvaⅡ(美国Promega)酶切消化,反应结束后行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定酶切结果。 结果 一、 尿常规检查外旋回血压检查 家系图见图3,Ⅳ8为先证者。家族成员的临床资料见表1。在该家系中除Ⅱ1未进行尿常规检查外,Ⅲ1、Ⅲ2、Ⅲ3、Ⅲ6、Ⅲ7、Ⅲ8和Ⅳ1、Ⅳ9、Ⅳ1 0均有镜下血尿,同时Ⅲ2、Ⅲ7、Ⅲ8和Ⅳ9合并有蛋白尿。家系中Ⅲ1和Ⅲ2、Ⅲ6和Ⅲ7为近亲婚配。除先证者外,家系成员血压正常、肾功能均正常。 二、 家系及菌株基因型的变化 1.先证者Ⅳ型胶原COL4A3及COL4A4基因突变筛查:先证者Ⅳ型胶原COL4A3及COL4A4基因的98个外显子经PCR扩增后测序,共发现11个基因变异位点。其中COL4A3基因第42外显子的变异为1个错义突变,即第3725位的鸟嘌呤突变为腺嘌呤(G3725A),导致Ⅳ型胶原α3链第1242位甘氨酸突变为天冬氨酸(G1242D),正常对照中无同类突变,见图4。此外,在COL4A3及COL4A4基因上检测到的10个序列变异,经文献检索均为已经报告的DNA多态性位点,见表2。 2.先证者家系基因突变位点G3725A基因型及表型相关性分析:由于COL4A3基因第42外显子的第3725位核苷酸存在内切酶AvaⅡ[G*G(A/T)CC]的酶切位点,而该位点G→A突变可使酶切位点丧失。为了明确该突变的致病性,我们对该家系的20名家系成员进行了AvaⅡ酶切鉴定。切酶AvaⅡ在正常人序列中有3个切点,即切成103 bp,78 bp和9 bp。由于9 bp片段很小,电泳无法显示,故该位点酶切后家系中的正常人可见103 bp和78bp 2条带;而先证者Ⅳ8 PCR产物经AvaⅡ酶切电泳后呈现103 bp和156 bp两条带,证实AvaⅡ酶切位点丧失,进一步测序验证存在G→A突变,并且为纯合子,临床呈现典型的AS。家系中Ⅲ1、Ⅲ2、Ⅲ3、Ⅲ6、Ⅲ7、Ⅲ8及Ⅳ1、Ⅳ9、Ⅳ10成员的酶切电泳结果表现为156 bp、103 bp和78 bp 3条带,表明这些成员的1条染色体存在G→A突变,该位点为杂合子,在临床上表现为血尿和(或)蛋白尿,但是肾功能均正常。见图5。正常对照(100条染色体)未见G1242D突变。 关于AS既往多