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显微镜概述 ——显微镜的原理与应用简介 显微镜——用来观察微小物体的特殊眼镜 Microscope ——在14世纪意大利人发明了眼镜， 从此拉开了制造显微镜的序幕 Small (小) ；to View (看) 海马齿状回 斑马鱼 神经元 单镜片显微镜 1600s荷兰商人列文虎克使用单 镜片显微镜发现微生物而成为“ 显微镜之父” 标本夹 镜 Antonie van Leeuwenhoek (列文虎克) 1600s晚期列文虎克所制造的单镜片显微 列文虎克绘制的木片结构 镜片 目镜 照明部分 油灯 水瓶 黄铜镜筒 对焦旋钮 物镜 样品架 复合式显微镜 罗伯特 ·虎克使用复合式显微 镜提出细胞 (Cell) 的概念 约1670年虎克所使 用的复合式显微镜， 其已具备现代显微 镜的所有部分。 显微镜原理 1)两次放大。第一次成 放大的实像，第二次成 放大的虚像。 2)样品处于物镜焦平面， 因而物镜与筒镜间形成 平行光线，中间距离可 无限延长 (无限远光学 系统) 。 3)成像在250mm明视距 离处。 视网膜 晶状体 目镜 物镜实像( 一次成像) 筒镜 物镜 样品 聚光镜 虚像 (二次成像 ) 样品 目镜 双目镜筒 镜头 镜身 物镜转盘 物镜 标本夹 载物台 开关 聚光器 视场镜 视场光栏 集光镜 底座 卤素灯 照明部分 显微镜的构成 调光 旋钮 移动手柄 物镜——显微镜的成像水平主要取决于物镜的好坏 (Objectives) 物镜主要特性： 1) 数值孔径 2) 分辨率 3) 工作距离 4) 消象差色差 分辨率 = 0.61λ/N.A. λ： 光的波长 (550 nm) NA：物镜的数值孔径 2) 分辨率 (Resolution) ——分辨率与放大倍数没有关系 大约300 nm 0.95 大约200 nm 1.40 分辨极限 点光源像 损失光线 艾里斑与分辨率 物镜 利用光线 N.A. 干物镜 油镜 无法分辨 损失光线 利用光线 点光源像 分辨率 筒镜 4) 象差(Aberration), 色差 (Chromatic Aberration ) 不同波长的光具有 不同的折射率，而 使焦点产生了偏移 通过粘合不同折射率 的镜片而校正色差 光学畸变可通过 制造工艺解决 真实图像 象差图像 Plan Apo：平场复消色差 (Plan Apo： 复消色差 (Apochromat) 各厂家物镜 无标识：消色差 (Achromat) Plan： 平场消色差 (Plan Achromat) 固定螺纹 色差校正 数值孔径 工作距离 色环 校正环 前镜头装置 特殊观察方 式 镜筒长度 盖玻片厚度 范围 盖玻片厚度刻度 通过物镜表示分辨物镜的特性 Leica 系列物镜 齐焦距离 45mm 生产商 平场校正 放大倍数 Olympus UIS2物镜 Zeiss IC2S物镜 Apochromat) 齐焦距离 45mm 齐焦距离 45mm 目镜 (Eyepiece) 视野 指观察范围 眼镜所观察到的视野= 目镜倍率×视野数(如下为22cm相当于在 眼前25cm处有一直径为22cm的圆形屏幕) 实际在样品上的观察区域(实际视野) = 目镜视野数／物镜倍率 如使用40X物镜实际视野=22mm/40=0.55mm 目镜 倍率 样品 孔径光阑 视场光阑 聚光器 (Condenser) 唯有均匀与高强度的照明才能获 得最佳的分辨率与良好对比度 August Köhler 柯勒照明(Köhler Illumination)正解 决了这一问题 聚光器的调节 尼康首创复眼照明技术 形成多重光源是照明更加均匀 复眼照明 普通照明 常用显微镜观察方式 1)明视场透射光观察 (Brightfield) 筒镜 物镜 样品 聚光器 投射光源 Ø 克服了相差观察式存在的光 晕，可以看到更微细的结构。 Ø 对比度更好，影调更丰富。 Ø 即使标本的折射率有变化， 仍能得到很好的观察效果。 尼康切趾相差物镜 (ApodizedPhase Contrast) ——使象差观察的光晕减少一倍 普通相差 尼康切趾相差 检偏镜 DIC棱镜 物镜 样品 聚光器 DIC棱镜 起偏镜 投射光源 DIC将样品厚度信息转化为光强信息 HeLa细胞 线虫 3) 微分干涉显微镜 (Differential Interference Contrast ，DIC) 样品厚度 DIC成像光强度 显微镜的基本类型 1) 正置显微镜 ——物镜在样本的上方 主要用于各类切 片的研究，尤其 多在病理切片观 察中使用。 2) 倒置显微镜——物镜在样本的下方 由于培养细胞的广泛应用尤其在 基础研究领域倒置显微镜成为更