高效液相色谱法测定人血浆中黄芩苷.docxVIP

高效液相色谱法测定人血浆中黄芩苷 当药物进入身体后，它可以与体内的各种生物高度结合，如药物与受体的结合、药物与核酸的结合等。药物与血浆蛋白的结合也是药物与生物高官结合的，上述两种结合均有一定的相关性。因此，药物与血浆蛋白的结合是药理学基础理论研究的重要内容之一。 高度结合时(一般指80%以上)还具有下列临床意义:延缓药物经肾排泄;延缓进入细胞外液,从而影响药物体内分布;药物的药理作用强度常常只与血浆中未与蛋白结合的游离浓度成线性关系,故在设计最适给药方案时,常需考虑血浆蛋白结合率. 1 试验材料和条件 1.1 药品、试剂和材料 仪器:635高效液相色谱仪;200-10型UV-VIS分光光度计. 样品:黄芩苷(深圳南方药厂提供);黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所);呋喃苯胺酸(沈阳第一制药厂). 试剂:3%磺酸水杨酸试剂;透析液(pH7.4的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液,内含0.15 mol/L NaCl). 材料:正常人血浆(沈阳军区总医院血液科提供);管状半透膜(周长5 cm,长10 cm). 1.2 流动相、柱温 色谱柱: C18(5 μm) 4 mm×250 mm ;流动相:甲醇-水-乙酸(体积比为60∶39∶1);流速:0.9 mL/min; 柱温:室温;检测器:276 nm(UV-VIS分光光度计). 1.3 试验条件 1.3.1 吸收最大波长的选择 经紫外全波长扫描,黄芩苷在276 nm处有最大吸收,故选用276 nm处测定. 1.3.2 流量选择 经比较选择,作者所用流动相分离完全,血浆杂质无干扰,见图1. 2 实验方法 2.1 标准曲线的绘制 精密吸取黄芩苷对照品甲醇溶液(10.0 mg→100 mL)0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3 mL,置于10 mL容量瓶中,加甲醇液至刻度,配成5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 μg/μL系列对照溶液.精取内标呋喃苯胺酸(250 mg→25 mL) 贮备液适量,加甲醇得到0.125 μg/μL内标溶液.用甲醇配制黄芩苷系列标准液,精密加内标溶液80 μL,混匀振荡10 min,放置0.5 h, HPLC分析测定峰高,以黄芩苷与速尿峰高比为横坐标,以黄芩苷进样浓度为纵坐标,绘制标准曲线.回归方程为:C=0.015 28A-3.333×10-3(r=0.999 0,n=10). 结果表明:黄芩苷的浓度测定值在5～60 μg/mL范围内呈线性关系. 2.2 回收率与精密度测试 精密吸取黄芩苷样品溶液在5 μg/mL、15 μg/mL、25 μg/mL 3个水平上重复进样5次, 结果见表1. 2.3 不同方法处理对麻黄苷浓度测定的影响 一份样品(含有黄芩苷)经甲醇沉淀后,各取1 mL上清液于6支试管中,其中3管于90℃水浴空气吹干,另3支管于25℃下氮气吹干,结果:SX1-X2=0.292 4,t=0.167 5(t0.05=2.776 4,t0.1=2.131 8),P0.1,所以经两种不同方法处理黄芩苷浓度测定值无显著差异,见表2. 2.4 hplc分析 取血浆1 mL加甲醇4 mL,混匀振荡15 min,然后以2 500 r/min离心10 min,取20 L进行HPLC分析,结果表明:空白血浆无干扰.采用本法可将黄芩苷、呋喃苯胺酸与血浆杂质完全分离. 2.5 标准品溶液的合成 在1 mL空白血浆中定量加入黄芩苷,精密加入内标物呋喃苯胺酸15 μg、甲醇4 mL,沉淀蛋白,配成5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg/mL.于混合振荡器上振荡10 min,以2 500 r/min离心8 min.取上清液,90℃水浴空气吹至0.25 mL左右,HPLC进样测定. 将浓度与黄芩苷和速尿峰高之比作线性回归,在黄芩苷浓度为5～35 μg/mL范围内线性关系良好.回归直线方程:C=0.015 23A+1.066×10-3(r=0.998 0). 2.6 血浆回收率与精密度测试 在3个黄芩苷浓度(5 μg/mL、15 μg/mL、25 μg/mL)水平上测定了回收率与精密度,结果见 2.7 测定蛋白质结合率的测定 2.7.1 袋外透析时间的确定 将管状半透膜一端用线扎紧,保证不漏,保留结扎线段10 cm左右,以便调节袋内外液面之用.用吸管加入血浆样本2.5 mL到上述半透膜袋内;折叠并结扎袋口,使袋内保留少量空气,使透析袋能悬浮在缓冲液内,不致沉入底部.将两端结扎的半透膜袋置于盛有10 mL透析液的30 mL广口瓶中,用袋两端残留线段调节袋内外液体,使保持同一水平,排除因液面相差引起液体流动.除实验样本外,另外用2.5 mL透析液代替血浆,操作同上