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冻干处理对聚合人胎盘血红蛋白质量的影响 冻干制品的加工和储存 血液交叉产品是国际上最受关注的研究主题之一，血液交叉产品（hboc）主要用于天然血红蛋白（包括人和动物）的血液提取物。聚合人胎盘血红蛋白 (polymerized human placenta hemoglobin, PolyPHb) 溶液是以人的胎盘血为主要原料的HBOCs, 具有携释氧、抗休克及改善微循环的功效, 是我国杨成民创新开展的课题。但是这类溶液在液体剂型条件下尚存在保存不稳定、高铁血红蛋白 (methemoglobin, MetHb) 含量增长、生成高分子聚合物等现象, 这些不稳定因素将影响制品的保存稳定性。解决这个问题的最有效的办法就是对液态HBOCs采取国际公认的冻干保存的方法。据文献报道, 酶、蛋白和肽类药物作为固态存在时具有更好的稳定性。冷冻干燥是对生物活性物浓缩和干燥的温和手段, 酶学家将其作为常规技术已有40余年。与其他干燥方法 (如热风烘干、微波干燥等) 相比, 冷冻干燥法有很大的优越性:由于在低温、真空状态下完成整个干燥过程, 因而保持了蛋白的生物活性, 尤其对于热敏和易氧化的物料;冻结时被干燥制品可形成“骨架”结构, 干燥后能保持原形, 体积几乎不变;冻干制品疏松多孔, 呈海绵状, 复水性好, 可迅速吸水还原成冻干前的状态;制品脱水彻底, 能长期保存。 HBOCs冻干剂型有利于运输、储存, 而且制品内的含水量很低, 分子运动受到限制, 各种物理化学反应速度大大降低, 稳定性提高, 因而是一种理想的储存方法。但文献报道, 冻干中冷冻和干燥过程均会使生物蛋白制品的结构及性质发生不同程度的改变, 因此急需全面考察冻干处理对HBOCs质量的影响。目前, 国内外关于冻干处理对HBOCs质量影响的研究鲜有报道, 因此本研究通过全面检测冻干前后制品的各项指标考察冻干处理对PolyPHb溶液理化质量和生物活性的影响。 1 材料和方法 1.1 仪器、仪器和仪器 PolyPHb溶液由中国医学科学院输血研究所提供;其它试剂为分析纯;labconco freezone12冻干机 (美国labconco公司) ;Thermo scientificforma超低温冰箱 (美国Thermo公司) ;DU800可见/紫外分光光度计 (美国贝克曼公司) ;2695分析型高效液相色谱仪 (Waters) ;J-815圆二色谱分仪器 (日本JAS-CO公司) ;Hemoxtm-Analyzer血氧分析仪 (美国TCS Scientific公司) ;BSA124S电子天平 (北京赛多利斯公司) ;Jan-19电热干燥箱 (美国Thermo公司) ;落地冷冻离心机 (湖南湘仪实验室仪器开发有限公司) ;FE20pH计 (Mettler Toledo公司) 。 1.2 灌装及冷却干燥法 参考文献的报道, 按蔗糖与血红蛋白 (hemoglobin, Hb) 质量比为1∶1, 加入保护剂蔗糖, 加水将蛋白浓度稀释至5.0g/dL。然后采用抽真空、通氮的方式对溶液脱氧, 并在通氮条件下分装至10mL西林瓶中, 每瓶装量2 mL, 高度约10 mm。将装入样品的西林瓶放入-70℃深低温冰箱冷冻5h。打开冻干机, 温度降至最低温度-35℃后, 将西林瓶半开盖放到冻干机真空干燥室中进行干燥。冻干程序为:第一阶段干燥:-35℃→35℃, 16h;第二阶段干燥:温度35℃, 保持10h。冻干程序结束后压盖, 充入氮气开箱, 取出样品瓶, 采用铝箔复合膜热合包装。 1.3 hb浓度的测量 采用HiCN法测定。 1.4 methb浓度的测量 采用分光光度法测定。 1.5 氧气运送量测定 改良“舒劳氏法”。 1.6 游离铁的三价含量测定 采用邻二氮菲分光光度法测量。 1.7 澄明度 按《中华人民共和国药典》 (二部, 2010版) , 附录ⅨB澄清度检查法进行检测。 1.8 非可溶性颗粒 采用显微计数法, 按《中华人民共和国药典》 (三部, 2010版) , 附录ⅨC不溶性微粒检查法进行检测。 1.9 可见异物 采用灯检法, 按《中华人民共和国药典》 (三部, 2010版) 可见异物检查法检测。 1.10 外观 肉眼观测, 应为均匀棕红色疏松体, 无起泡、塌陷现象。 1.11 加入溶剂的时间 根据样品冻干前后质量差加入相应体积的灭菌注射用水, 轻轻摇晃小瓶使其溶解, 用秒表记录溶解开始时间。肉眼观测瓶内无可见颗粒即为溶解结束时间。 1.12 剩余重量 干燥失重法, 按《中华人民共和国药典》 (三部, 2010版) , 附录ⅧL干燥失重测定法, 进行水分测定。 1.13 紫外光谱扫描 样品浓度稀释至0.01%, 扫描波长范围200~700nm。 1.14 圆二铬扫描 Hb浓度稀释至0.3g/L, 扫