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传统中药蝉选提取物的提取与抑菌活性研究 钩子（pc）是钩子科昆虫黑虫的幼虫。它是期末的体壁，也被称为轻衣服、轻退出、轻壳和轻甲。首载于《名医别录》，蝉蜕性甘、寒，味咸，是一种常用中药，具有散风解热、清肺利咽、解表透疹、解毒消炎、清肝明目，安神定志、止咳平喘、息风止痉、明目退翳之功效，临床上常用于治疗风热感冒，咳嗽音哑，咽喉肿痛，小儿惊痫，惊风抽搐，风疹瘙痒，痘疹疔疮，破伤风等病症。 随着科学技术的发展，其功效不断地被发现，且效果明显，现代药效学证实，蝉蜕具有如抗癌、镇痛、抗过敏等作用，但对其是否有抑菌作用，截止目前还没有研究报道，因此，本研究以蝉蜕为材料，采用不同提取方法对蝉蜕的活性成分进行初步分离，并对各种提取方法所得蝉蜕提取物进行了体外抑菌活性研究，为深入了解蝉蜕的化学组成和抑菌作用提供基础数据。 1 材料和方法 1.1 材料、试剂与仪器 蝉蜕购自西安药材公司，大肠杆菌Escherichia coli由西北农林科技大学植保学院分子病毒学实验室提供，蛋白胨、酵母提取物购自OXOXID，牛肉膏购自北京奥特星生物技术有限责任公司，琼脂粉购自润德生物，其余化学试剂均为分析纯。 1.2 仪器、检测方法 电热鼓风干燥箱(101-I北京科伟永兴仪器有限公司)、循环水式多用真空泵(SHB-III郑州长城科工贸有限公司)、旋转蒸发仪(R205上海申生科技有限公司)、三用紫外仪(ZF-2上海市安亭电子仪器厂)、台式三频数控超声波清洗器(KQ3200昆山市超声仪器有限公司)、UV-2550型紫外可见分光光度计(SHIMAPZU CORPORATION)、SW-CT-IF超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、千分之一电子天平(岛津)、P型移液器(吉尔森)。 1.3 制备样品，粉碎样品 蝉蜕拣选清洗除杂3～4次，反复漂洗，直至水澄清，然后将样品放在报纸上摊开，置于60℃鼓风干燥箱中恒温鼓风加热干燥8 h，称重后高速粉碎机粉碎，粉碎后样品过60目筛备用。 1.4 提取方法的确定 分别采用冷浸法、煎煮法、超声波提取法、微波提取法进行提取。不同方法提取，均合并3次的提取液。将每种方法收集到的提取液上旋转蒸发仪蒸发至浸膏。称其质量，计算得率。每组试验平行进行3次，结果取平均值。 1.5 提取溶剂的选择 分别采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、95%乙醇、甲醇作为提取溶剂，按照1.4中超声波方法提取，分析比较各种溶剂的提取效果。每组试验平行进行3次，结果取平均值。 1.6 姜提取提取物的生物活性试验 1.6.1 供试液的制备 取1 g不同提取方法和不同提取溶剂所获得的浸膏干样溶于丙酮中并定容为1 g/mL，按不同浓度稀释后制成供试液，过滤灭菌后装入灭菌离心管中备用。 1.6.2 供试比色测试 挑取大肠杆菌单菌落接种于肉汤培养基，置37℃培养4～6h后用生理盐水校正浓度为0.5麦氏比浊标准，约含大肠杆菌1×108CFU/mL，然后再用肉汤培养基稀释10倍后使用，约含大肠杆菌1×107CFU/mL，作为测定用E.coli培养液。 分别无菌操作配制以下供试比色溶液:(1)CK:LB培养基(5 mL)+E.coli培养液(50μL)+无菌水(100μL);(2)丙酮(浸膏溶剂)对照:LB培养基(5 mL)+E.coli培养液(50μL)+溶剂(50μL);(3)试样:5 mL液体LB培养基+E.coli培养液(50μL)+分别加4种不同提取方法的供试液(50μL)。所有测试均重复3次，6个处理，共计18个样本。 将以上6个处理的18支试管于37℃恒温摇床培养，每隔30 min分别取其中培养液5μL，稀释100倍用UV-2550型紫外可见光分光光度计在375 nm波长下检测试样吸光度，测得数据进行比较分析。若供试管的吸光度小于对照管，表明供试液有抑菌活性，若吸光度大于或等于对照管，则表示该供试液无抑菌活性，吸光度越大，表明其抑菌活性越小。 1.6.3 培养基抑菌圈测定 以不同提取方法和不同提取溶剂提取所获得的浸膏用丙酮配制0.1 g/mL的供试液，以丙酮作为溶剂对照样品，将每种供试样品和对照样品无菌制备6个药敏片，分别帖于含1×106CFU/mL E.coli的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，培养皿倒置，于37℃恒温培养箱中培养24 h。培养结束后，用刻度尺测量培养基中抑菌圈的直径。重复试验6次，取平均值作为抑菌圈的最终结果。 1.6.4 最低抑菌浓度测定 取95%乙醇超声波提取物25 mg浸膏置于试管中，先加入0.5 mL丙酮溶解样品，再加入4.5mL肉汤培养液配成5 mg/mL的供试液;另取0.5 mL丙酮、4.5 mL肉汤培养液混匀配成丙酮肉汤培养液，每支测试试管中接菌浓度为1×106CFU/mL的E.coli菌液0.05 mL。供试液浓度依次为2.5、1.