细胞生物学研究方法详解演示文稿.pptVIP

间接免疫荧光法 本文档共164页；当前第94页；编辑于星期二\5点28分 免疫胶体金技术原理? 免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。 胶体金是由氯金酸在还原剂作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。 本文档共164页；当前第95页；编辑于星期二\5点28分 胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金 本文档共164页；当前第96页；编辑于星期二\5点28分 胶体金应用 本文档共164页；当前第97页；编辑于星期二\5点28分 胶体金应用 胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组化外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。 本文档共164页；当前第98页；编辑于星期二\5点28分 四、细胞内特异核酸的定位与定性 ?光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针） ?电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合） 　　　　 本文档共164页；当前第99页；编辑于星期二\5点28分 核酸分子杂交 按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链的DNA/DNA，RNA/RNA，RNA/DNA，互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交 本文档共164页；当前第100页；编辑于星期二\5点28分 常用核酸分子杂交技术 ①Southern印迹杂交； ②Northern印迹杂交； ③斑点杂交( dot blotting)； ④原位杂交(in situ hybridization) 本文档共164页；当前第101页；编辑于星期二\5点28分 Blotting：印迹\杂交 Southern Blotting: 检测特定DNA片断 Northern Blotting: 检测RNA Western Blotting: 检测蛋白质 本文档共164页；当前第102页；编辑于星期二\5点28分 斑点杂交 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。 本文档共164页；当前第103页；编辑于星期二\5点28分 原位杂交（in situ hybridization) 应带有标记的（有放射性同位素、荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质)DNA或 RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内待测核酸片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DNA 的存在与定位；也可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。 本文档共164页；当前第104页；编辑于星期二\5点28分 荧光原位杂交 （fluorescence in situ hybridization, FISH） 本文档共164页；当前第105页；编辑于星期二\5点28分 人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 本文档共164页；当前第106页；编辑于星期二\5点28分 合 成 本文档共164页；当前第107页；编辑于星期二\5点28分 The is a technique used in molecular biology research to study gene expression by detection of RNA in a sample. A southern blotting B western Blotting C northern Blotting D fluorescence in situ hybridization √ 本文档共164页；当前第108页；编辑于星期二\5点28分 五、放射自显影技术 ?原理及应用： 利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究； 实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 ?步骤： ?标记前体物掺入细胞 ?放射自显影追踪 本文档共164页；当前第109页；编辑于星期二\5点28分 标记物 一般常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TdR）来显示DNA 用3H尿嘧啶核苷（3H-UdR）显示RNA； 用35S标记的甲硫氨酸、半胱氨酸，3H或14C标记的甲硫氨酸、亮氨酸研究蛋白质 用3H甘露糖、岩藻糖