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实验性脊髓空洞前状态神经细胞死亡方式的实验研究 脊柱空洞综合征（sm）是一种隐蔽性脊髓炎病，进展缓慢，没有有效的治疗方法。我们以前的研究证实, 脊髓空洞在形成前的两周内存在着缺血、水肿, 称之为空洞形成前期, 国外称之为空洞前状态。近年来, 有证据表明在神经系统急、慢性损伤中可见到凋亡发生, 但脊髓空洞前状态中是否存在细胞凋亡未见报道。为此, 本研究拟检测脊髓空洞前状态中神经细胞坏死和凋亡情况, 为进一步深入了解脊髓空洞形成机制提供理论基础。 术后处理和观察 1.动物分组:将56只健康、体重1.5～2.0kg的新西兰白兔 (雌雄不限) , 随机分为3组, 其中Kaolin组40只, 生理盐水组和假手术组各8只。 2.动物模型制作: 在氯胺酮 (30mg/kg) 静脉麻醉下, 动物取俯卧颌低位, 颈后部备皮消毒。按文献方法, 用41/2号针头行经皮枕大池穿刺术, 缓慢抽取无色透明脑脊液0.6ml, Kaolin组动物缓慢注入37℃、25%Kaolin悬浊液0.6ml;生理盐水组动物仅注入37℃生理盐水0.6ml;假手术组只行枕大池假穿刺, 以作对照。模型成功标志:枕大池穿刺抽出无色、透明脑脊液, Kaolin顺利注入枕大池且动物出现一过性四肢瘫。麻醉清醒后2小时, 动物分笼饲养, 连续7天肌肉注射抗菌素预防感染并必要时给予营养支持。 3术后神经功能判定:术后每日, 按改良Tarlov评分法对动物进行行为学检查, 标准如下:0分:无自主活动;1分:仅限于髋膝关节的非反射性运动;2分:髋膝踝3个主要关节的活动;3分:能主动支持体重和不协调步态, 或偶尔出现协调步态;4分:前后肢协调的步态, 行走时有趾间关节的运动;5分:正常步态。 4.标本的制作和采集:生理盐水组和假手术组在术后, Kaolin组在第1, 3, 7, 14, 21d各随机选取各8只, 在氯胺酮过度麻醉下, 断头处死, 经后正中切口、咬除脊突和椎弓根, 取出上颈髓, 其中10mm标本用于测定脊髓含水量, 剩余上颈髓组织经后固定后用于组织学观察、电镜观察和神经细胞凋亡评定。 5.脊髓含水量测定:截取的10mm颈髓用滤纸吸除表面水分, 剔除kaolin沉积, 置电子分析天平 (分度值0.0001g) 称取湿重 (W) , 再经110℃恒温烤箱烘烤24h后称取干重 (D) 。应用公式:脊髓含水量 (%) = (W-D) /W×100, 计算出脊髓含水量。 6.标本制作和光镜、电镜观察:经后固定的标本常规脱水、透明、石蜡包埋、4μm连续切片用于HE染色观察。再取部分标本制作成1mm3大小的组织块, 2%戊二醛、1%四氧锇酸再固定, 618环氧树脂包埋、超薄切片, 醋酸铀-枸橼酸铅染色, H-7500透射电镜下观察。加速电压75KV。 7.TUNEL法检测细胞凋亡: 石蜡切片常规脱腊至水;加TBS 1∶100稀释Protenase K 37℃消化15min;TUNEL孵育液4℃过夜;加封闭液室温30min;用封闭液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体37℃ 30min;用封闭液1∶100稀释SABC加至切片37℃反应30min;DAB显色, 苏木素复染同时设立阳性对照及阴性对照片。细胞核中有棕黄色颗粒者为TUNEL阳性细胞, 即凋亡细胞。高倍视野 (×400) 下计算凋亡指数 (Apoptotic lndex, AI) , 即每张片选取5个阳性细胞数最多的高倍视野, 计算出平均阳性细胞百分数。 8.统计学分析:各组实验数据以xˉ±Sxˉ±S表示, 采用SPSS 11.0专用统计学程序进行方差分析。 结果 1. 神经功能障碍 Kaolin组动物除术后出现一过性四肢瘫外, 于术后第3d出现进食减少、精神萎靡, 第7d出现神经功能障碍, 包括反应迟钝、四肢无力、行走不稳, 甚至瘫痪, 并随时间的延长而逐渐加重, 甚至有的动物出现脊柱侧弯。而生理盐水组和假手术组动物食欲、精神未见异常变化, 亦未见神经损害体征出现。 2. 分组及持续时间为第7d时,基础上持续到第21d时,总有4. Kaolin组动物于术后第ld脊髓含水量就较对照组即有明显增加, 达68.35±0.70%, 至第7d达到高峰值, 为72.92±0.86%, 持续到第14天后, 于第21d时稍有缓解, 为70.03±0.77%, 但仍高于对照组 (表1) 。 3. 单次给药后中k Kaolin组动物于术后第3d神经元轮廓大致正常, 但出现神经细胞特别是神经元出现轻度肿胀、血管周围间隙稍增宽, 主要表现为细胞毒性水肿, 程度轻;第7d神经元水肿加重, 核膜、核仁稍显模糊, 尼氏体肿胀, 细胞周围间隙明显较前增大, 管周组织略显疏松, Kaolin性肉芽肿与脊髓粘连较轻。第14d细胞周围间隙明显较前进一步增大, 核膜、核仁模糊