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草决明中多糖提取工艺的优化及其含量测定 草决明是一部戏剧，也被称为明史、马蹄明、羊明等。为豆科一年生植物决明(Cassiaab tusifotia L)或小决明(C.toraL)的成熟种子。主产于安徽、广西、四川、浙江、广东等省。草决明是中医常用药之一,《神农本草经》将其列为上品。味苦、甘、咸,性微寒,入肝、肾、大肠。具有清热明目、润肠通便之功效,临床用途广泛,民间习惯作为咖啡代用品。现代药理研究表明,草决明具有降压保肝、增强机体免疫功能、滋补及抗衰老等多方面活性。多糖是一切生命有机体必不可少的成分,多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等有着密切的关系。进一步探讨草决明的药用价值,本研究对其多糖的提取工艺进行了优化。 1 实验材料 1.1 循环水式水泵和旋转蒸发仪 电热恒温水浴锅(HH·SYII-N2C型,北京市长风仪器仪表公司);分析天平(Adventurer,奥豪斯上海公司);循环水式真空泵(SHB-B95A型,郑州长城科工贸有限公司);旋转蒸发仪(RE-52A型,上海亚荣生化仪器厂);紫外分光光度仪(S/54,上海精密科学仪器有限公司);离心机(LXJ-IIB型,上海安亭科学仪器有限公司);电热恒温干燥箱(202-2AB,天津泰斯特仪器有限公司)。 1.2 试剂:葡萄糖、苯酚、硫酸 草决明(购于泰安药店,经泰山医学院药学院中药学教授鉴定);葡萄糖、苯酚(AR,天津市大茂化学试剂厂);硫酸(优级纯,天津市化学试剂三厂);去离子水;无水乙醇、正丁醇、氯仿、丙酮、乙醚均为分析纯。 2 线性关系研究 2.1 标准溶液的制备 精确称取干燥至恒重的葡萄糖25.0mg,加适量水溶解,转移至100mL容量瓶中,加水至刻度,摇匀,得250μg/mL储备液。 2.25 %苯试剂的制备 精确称取182℃蒸馏后苯酚5g,加水溶解于100mL棕色瓶,置冰箱中备用。 2.3 最大吸收苯酚测定 精确移取葡萄糖储备液0、5、10、20、25、30mL,置100mL容量瓶中,稀释定容。精密吸取 1.0mL各标准液至10mL刻度试管中,分别加入5%苯酚试液0.6mL,摇匀,加浓硫酸3.6mL,充分摇匀,室温放置30min。在200～600nm之间扫描,结果在490nm处有最大吸收。得回归方程A=0.0128C-0.1599(r=0.9992)。说明在12.50～75.00μg/mL之间呈良好的线性关系。 3 提取技术研究 3.1 正交实验配置 以L9(34)正交表进行实验,选择提取时间、提取温度、提取次数和料液比4个因素设计正交实验,因素水平安排见表1,实验设计见表2。 3.2 圆底烧液的制备 准确称取30g草决明于1000mL圆底烧瓶中,加入250mL 80%乙醇,在85℃水浴条件下回流2次,每次2h,过滤,残渣备用,见图1。 4 数据处理及分析 准确称取不同提取条件下多糖10mg溶解,定容至100mL,吸取1mL于刻度试管,按2.3项下操作,测定不同提取液中多糖的含量,数据处理采用正交试验直观分析法,统计不同水平的平均提取含量,以极差R(R为极大值与极小值之差)进行分析,结果见表3,方差分析以时间s=0.018值最小,见表4。多糖含量(%)=(c×100)/(w×106)×100%,c为浓度(μg/mL),w为待测样品质量(g)。多糖提取率=粗多糖沉淀量(g)/草决明量(g)×100%,草决明多糖总量=提取率×草决明多糖含量。 5 草决明中多糖的提取 从极差R值和方差分析来看,草决明中多糖提取含量的影响因素主次顺序为提取温度料液比提取次数提取时间;结合K值,90℃时草决明中多糖提取含量最高;另外,料液比对提取多糖影响也较大,料液比越大多糖的提取越完全,鉴于工业生产的可行性,选择1∶20;提取次数也有影响,以3次为宜;提取时间影响最小,根据结果选择3h。综合以上分析结果,草决明中多糖的最佳提取条件为:A2B3C1D3,即采用1∶20料液比,在90℃温度下,提取3次,提取时间3h。 6 测定茶多酚含量 6.1 准确度的研究 6.2 精密度试验 在490nm下,测定同一标准溶液吸光度(n=6),RSD为2.32%,表明精密度良好。 对同一样品每隔2h测定其吸光度(n=5),RSD为0.283%,结果表明相对稳定。 6.3 返回率实验 取草决明30.000g,乙醇脱脂后,残渣中加入适量葡萄糖对照品,在最佳提取条件下提取,测定回收率,见表5。 6.4 结果表1 称取适量草决明,在最佳提取条件下提取多糖,结果见表6。 本法提取的多糖含量很高,节省了大量的时间和溶剂,从而降低了生产成本,提高了经济效益,为开发新药,利用资源提供了理论参考。