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变性梯度凝胶电泳的研究进展 随着结构研究的结束，人类基因的神秘面纱逐渐暴露，已知基因的数量日益增多，几份遗传相关基因的数量也越来越多。但是, 在找到了候选基因后, 还需要在相关的遗传病病人中进行突变检测, 只有找到了相应的突变, 才能真正确定该基因与疾病的关系, 从而服务于临床。变性梯度凝胶电泳 (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 就是一种很有实用价值的突变分析方法。该方法经改进, 又发展出了恒定变性凝胶电泳 (constant denaturant gel electrophoresis, CDGE) 、瞬时温度梯度电泳 (temporal temperature gradient electrophoresis, TTGE) 和温度梯度凝胶电泳 (temperature gradient gel electrophoresis, TGGE) 。现在上述方法已经广泛应用于遗传病的诊断、突变分析和肿瘤相关基因的筛查等许多方面。 1 基本原则 1.1 凝胶电泳法 由Fisher和Lerman于1983年创立, 以后该技术和PCR技术相结合被广泛应用于各种突变分析。它主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段。电泳开始时, DNA在胶中的迁移速率仅与分子大小有关, 而一旦DNA泳动到某一点时, 即到达该DNA变性浓度位置时, 使得DNA双链开始分开, 从而大大降低了迁移速率。由于不同的DNA片段的碱基组成有差异, 使得其变性条件产生差异, 从而在凝胶上形成不同的条带。目前常用的变性剂有尿素 (urea) 和甲酰胺 (formamide) 。根据DGGE变性梯度方向与电泳方向是否一致, 可将其分为两种形式的DGGE:垂直DGGE和平行DGGE。垂直DGGE的变性梯度方向与电泳方向垂直, 可用于优化样本的分离条件, 也可用于分析PCR产物的组成;平行DGGE的变性梯度方向与电泳方向一致, 可用于同时分析多个样本。 检测某种突变的变性剂浓度一般通过变性梯度凝胶电泳来确定。实际应用时, 如果突变发生在高熔点区时, 往往难以检测到。这主要是由于DNA熔解区域温度的增加导致迁移率的变化减少, 难以将正常DNA分子和突变DNA分子分开。此外, 高熔点区的解链时间较长, 也使得应用DGGE受到限制。解决的办法一般是在PCR引物的5′末端加上一段40~50 bp的GC夹。但如果突变发生在CpG岛, 则检测仍有困难。 1.2 ge电泳法 Hovig等于1991年建立了一种恒定变性凝胶电泳 (CDGE) , 它是由DGGE经改变而来, 其主要化学物质和基本方法都一样, 只是凝胶浓度由垂直DGGE确定后, 用均一的变性浓度凝胶代替梯度凝胶, 使得整个电泳变得更加简单快速。 1.3 不同浓度尿素对聚丙烯酰胺凝胶电泳稳定性的影响 其检测突变的能力和DGGE差不多, 但却不需要变性梯度胶。基本方法是:在加有一定浓度尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中, 使外界温度恒定地增加, 这样在跑胶的过程中形成一个温度梯度, 变性环境是由恒定浓度的尿素和瞬时温度梯度共同形成。这样使得全过程更加简单迅速, 分辨率极高。 1.4 dage-dage控制 基本原理与DGGE差不多, 只是由变性剂形成的梯度被温度梯度所代替。这样的梯度可由微处理器控制, 与DGGE相比, 更加稳定可靠。如在变性高压液相色谱 (denaturing high pressure liquid chromatography, DHPLC)中, 其杂合双链和纯合双链的分离就是通过精确的温度控制, 使杂合双链部分变性, 从而与纯合双链分离开来。 2 dage和pcr检测dna区域的突变 ①突变检出率高。在TGGE中, 一般2 mm可对应0.6℃温差, 而在TTGE中, 每小时升温可控制为0.1℃, 极小的Tm值的差异也可以检测出来, 尤其适用于单对碱基突变个体的筛查。如果突变发生在最先解链的DNA区域, 则其检出率可不低于99%, 而其他方法如PCR/SSCP的检出率仅70%。②检测片段可达1kb, 尤其适于100bp~500bp的片段。而PCR/SSCP一般只适用于150bp~200bp, 对较大片段的突变检出率将大大降低。③DGGE对肿瘤的突变检测有困难, 尤其是实体瘤。仅改进后的CDGE和TGGE应用于肿瘤相关基因的筛查均已有文献报道。④加样量小。仅需1 ng~5 ng的DNA。⑤重复性好, 因为主要电泳条件都由微处理器控制。⑥操作简便, 快速。BIO-RED公司的Dcode普通突变检测系统最快在2小时内可检测64个样品。⑦该法的缺点是一般不能确定突变位置, 最终还得依赖于DNA测序。 3 温度调节装置 DGGE、CDGE、TTGE和TGGE的操作基本