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酶蛋白的基因工程技术研究进展 现在，生物酶剂在不同的领域被广泛使用。由于其易加工、起源丰富、性质多样等优点，微生物已成为酶制剂的主要来源。通常,应用于工业的微生物酶制剂主要是通过从自然环境中分离筛选获取。但是由于自然环境中微生物太多,大部分的微生物资源还没有得到成功的分离培养和筛选,因此,到目前为止人类获得的微生物酶的种类和数量是非常有限的。由于工业生产中常常伴随着高温、强酸、强碱、高盐、有毒介质等特殊反应体系,这就要求应用于生产的酶制剂能够适应这些相对极端的环境。而普通的酶制剂在极端环境中很容易失活,目前主要的解决办法是从极端环境中筛选微生物,以期获得能够适应极端环境的酶蛋白,但是这种方法最大的缺点就是取样困难,由于人类活动范围的限制,很多极端环境还不能够到达,而且由于微生物本身的特殊生长环境,现有的常规微生物分离培养方法不一定适用。当然,采用工程手段如酶固定化、包埋等能够在一定程度上改善酶制剂的应用性能,但这些方法得到的效果离现实要求还有一定的差距。在此背景下,利用分子生物学技术对现有的微生物酶资源进行改造,以得到更多具有优良性质的工业用酶成为微生物酶研究热点。 随着基因工程技术的应用,很多酶蛋白都已经实现了在毕赤酵母和大肠杆菌等工业生产菌株中的表达,但仍然存在有些外源蛋白的表达量很低的问题,严重影响其实现工业化生产和利用。研究人员也在通过各种基因工程的方法,希望能够提高酶蛋白的表达量。本文就目前微生物酶基因工程领域两个重要问题——通过分子改造改善酶蛋白应用性能和提高异源表达产量的方法,做一简要综述。 1 酶的设计改造 利用生物信息学对现有的大量的酶进行统计分析,结合定点突变、定向进化、融合表达等分子生物学技术,对现有的酶进行设计改造,可以使其具有预期优良性质,以达到更好、更广泛的利用目的。 1.1 催化剂的结构优化 定点突变是对酶基因进行改造的重要手段,通过在特定位点引入有益突变,经实验验证后得到具有优良性质的酶蛋白,突变位点可以是单一的,也可以是多个位点。定点突变的成功实施需要建立在对酶蛋白结构与功能、催化机理及活性位点充分了解的基础上,属于理性设计的范畴,所以对目标酶蛋白的分析工作就非常重要,往往需要生物信息学手段的辅助才能实现。KorKegion等通过计算酶的热稳定性,对酵母胞嘧啶脱氨酶(yeast cytosine deaminase, yCD) 引入A23L,I140L和V108I三个点突变,突变后酶催化效率不变,热稳定性大大提高,Tm值提高10℃,并且在50℃时的半数失活时间提高30倍。Jeone等通过同源建模及结构分析,将Bacillus stearothermophilus来源木聚糖酶的Ser100和Asn150突变为Cys,构建了一个分子内二硫键,增加了稳定性,从而使其稳定性提高。除了热稳定性,改善酶的pH稳定性,提高酶催化效率等目的也可以通过点突变来实现。Mahadevan等对来源于Thermotoga maritima的内切纤维素酶(endoglucanase)Cel5A进行定点突变后,最适pH由5变成了5.4,突变后酶活性提高10%; Kang等将来源于Pyrococcus horikoshii的β-1,4-endoglucanase(EGPh)106/159/372/412位半胱氨酸突变后,对甲基纤维素的酶活提高2.3倍;Heckman等在大肠杆菌中表达了来源于Peniophorasp.的pyranose 2-oxidase (P2Ox),在分析其晶体结构的基础上,引入了E542K和T158A两个点突变,得到突变酶P2OxA2H,在60℃具有较高的稳定性,pH稳定范围从野生型的5.0~7.5扩展到3.5~11.5,对 D-Glucose, L-Sorbose,D-Xylose的酶活分别提高14、28和69倍,催化效率分别提高230、874和1751倍。定点突变目的性强,不需要进行大量的筛选工作,但是前期的分析工作很重要,往往需要积累很多的知识以及在大量的前期研究基础之上才能很好地实施。因为设计的突变位点不合适的话,不仅不能达到改善的目的,而且还可能起到相反的效果。对于那些结构与功能,催化机理等了解不充分的酶基因,往往在使用定点突变时感到无从下手,应尽量采取其他的突变策略。 1.2 易错pcr与dna-shuffing的组合关系 定向进化是指在实验室模拟基因自然进化的过程,构建包含有大量突变体的突变体库,然后通过特定的方法从突变体库中筛选到特定性质的蛋白。定向进化属于非理性设计,不需要事先了解酶的结构、催化机理、活性位点等因素,是在实验室人为创造进化条件,使目标酶蛋白在短时间内完成在自然界需要成千上万年才能完成的进化过程,得到多样性的突变体库,然后通过定向筛选,得到有预期性质的酶。定向进化主要包