遗传修饰动物模型.pptVIP

通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。 本文档共229页；当前第159页；编辑于星期一\4点35分 基因敲入（gene knock in）是利用基因同源重组，将外源有功能基因（基因组原先不存在、或已失活的基因），转入细胞与基因组中的同源序列进行同源重组，插入到基因组中，在细胞内获得表达的技术。 第三节 用基因打靶建立动物模型 本文档共229页；当前第160页；编辑于星期一\4点35分 为什么有转基因技术还要开展基因打靶技术？ 转基因技术的缺陷： 1) 由于转基因随机插入,相邻基因组序列可能对其产生影响. 2) 整合转基因拷贝数有很高的差异. 3) 为保证转基因表达,注入的DNA 带有所有的调控成分,调控成分可能远离编码序列或位于复杂基因的内含子中,难以操作. 4) 不能研究具有显性致死表型的转基因. 本文档共229页；当前第161页；编辑于星期一\4点35分 基因打靶技术不但可以克服以上问题，还有如下优点： 1)可以通过同源重组精确控制整合位点, 2)可以检测随机整合的ES细胞克隆的转基因拷贝数和转基因的表达. 第三节 用基因打靶建立动物模型 本文档共229页；当前第162页；编辑于星期一\4点35分 基因敲除载体策略：插入型和置换型 插入型载体设计时, 选择基因在同源序列之外或之内, 导入宿主细胞前, 需将打靶载体在同源区制造一个线性化缺口, 这样会使同源重组效率提高。插入型载体与靶基因在同源区发生一次单交换后, 将造成整个载体插入染色体同源区, 从而使同源序列增加一个拷贝。 第三节 用基因打靶建立动物模型 本文档共229页；当前第163页；编辑于星期一\4点35分 缺点： 1、不能区分随机整合与同源插入 2、留下的选择标记及其启动子、增强子可能会影响邻近基因的表达 3、串联重复序列不稳定 第三节 用基因打靶建立动物模型 本文档共229页；当前第164页；编辑于星期一\4点35分 本文档共229页；当前第165页；编辑于星期一\4点35分 本文档共229页；当前第127页；编辑于星期一\4点35分 本文档共229页；当前第128页；编辑于星期一\4点35分 本文档共229页；当前第129页；编辑于星期一\4点35分 第二节　　研制转基因动物的基本步骤 YAC的缺点： 1、内部存在嵌合及重组等现象，即在一个YAC克隆里含有两个本来不相连的独立片段； 2、某些克隆不稳定，在转代培养时可能会缺失或重排其中的片段 ； 3、此外，由于YAC与酵母染色体具有相似的结构，因此YAC很难与酵母染色体区分开，并且在转基因操作时必须特别小心,以防染色体机械切割。 本文档共229页；当前第130页；编辑于星期一\4点35分 第二节　　研制转基因动物的基本步骤 BAC为环形质粒，其复制子来源于单拷贝质粒F因子，故BAC在宿主菌内只有极少数拷贝数，可稳定遗传，无缺失，重组和嵌合现象，能容纳300kb的DNA分子。 本文档共229页；当前第131页；编辑于星期一\4点35分 第二节　　研制转基因动物的基本步骤 BAC以E.coli为宿主，转化效率较高，常规方法(碱裂解)即可分离BAC：蓝白斑，抗生素，菌落原位杂交等均可用于目的基因筛选； 可对克隆在BAC的DNA直接测序 本文档共229页；当前第132页；编辑于星期一\4点35分 本文档共229页；当前第133页；编辑于星期一\4点35分 第二节　　研制转基因动物的基本步骤 转入基因的整合、表达及转基因动物的鉴定 外源基因导入后的存在方式 1.整合到染色体内 随机整合（非同源重组）定点整合（同源重组） 2.游离在细胞浆内暂态表达 3.在核酸酶的作用下降解。 本文档共229页；当前第134页；编辑于星期一\4点35分 外源基因导入后的表达 表达影响因素 1.外源基因本身的结构和性质 2.附带的原核载体顺序 3.染色体位置 4.甲基化 5.外源基因在受体细胞中的表达方式表现为组织特异性和发育阶段特异性 第二节　　研制转基因动物的基本步骤 本文档共229页；当前第135页；编辑于星期一\4点35分 第二节　　研制转基因动物的基本步骤 转基因动物的鉴定 从小鼠尾尖提取基因组DNA为模版进行如下鉴定 1、DNA水平的检测：①PCR鉴定：引物设计应区分内源外源基因；②Southern印迹杂交和FISH(荧光原位杂交)：确定整合位置； 2、mRNA的检测:northern-blot 、RT-PCR 3、蛋白产物的检测：Western blot等 4、表型检测：血液生化，病理、免疫组织化学 5、报告基因检测 本文档共229页；当前第136页；编辑于星期一\4点35分 第二节　　研制转