谷氨酰胺对肉仔鸡肠道淋巴细胞增殖和抗氧化的调控作用.docxVIP

谷氨酰胺对肉仔鸡肠道淋巴细胞增殖和抗氧化的调控作用 胃作为身体的重要组成部分，不仅是食物吸收的主要场所，也是许多疾病进入身体的主要场所。近10年来,由于全胃肠外营养(TPN)和要素饮食等方面的研究和应用,人们发现肠道营养对肠道黏膜免疫有较大影响。谷氨酰胺(glutamine,Gln)是动物体内含量最丰富的氨基酸之一,为条件性必需氨基酸,可作为反映动物体免疫功能强弱的一个有效指标。在应激条件下,动物机体对Gln的需要量大大超过了机体合成Gln的能力,这时体内Gln含量降低,蛋白质合成减少,出现小肠黏膜萎缩与免疫功能和抗氧化功能低下等现象,Gln对维护动物肠道黏膜屏障发挥重要的作用,并可提高动物生产性能。Dong等研究发现,蛋鸡饲粮添加0.8%Gln可以明显改善蛋鸡十二指肠和输卵管的发育,并显著提高产蛋率。Gln可以为快速分裂细胞,如肠黏膜上皮细胞和活化的淋巴细胞等提供能源,也可在促进受损伤肠道的修复以及维持正常的局部免疫功能中发挥着其他氨基酸不可替代的作用。在短暂的生长周期中,肉仔鸡肠道会接触大量的致病性抗原,肠道黏膜免疫系统生理功能很难在短时期内发育完善而多会在肉仔鸡生长前期出现肠道炎症性疾病。本试验用2种不同应激原刺激肉仔鸡肠道黏膜淋巴细胞,建立体外肠道黏膜氧化应激和免疫应激模型,旨在通过在肠道黏膜淋巴细胞水平上研究Gln对应激原刺激后的肠道淋巴细胞抗氧化及抗免疫应激的调控作用,为Gln营养改善肉仔鸡肠道健康状态提供更为直接的理论依据。 1 材料和方法 1.1 试剂和试剂盒 二氧化碳培养箱(Thermo)、酶标仪(BioTek,PowerWaveXS2)、超净台(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)、倒置相差显微镜(Nikon,Eclipse E 200)、离心机(Sigma)。 脂多糖(LPS)、Gln、胶原酶-Ⅰ、氨苄青霉素、硫酸链霉素均购自Sigma公司;淋巴细胞分离液购自上海瀚洋生物制品公司;小牛血清购自浙江杭州四季青公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Amresco公司;RPMI 1640培养液购自Gibco公司;超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量检测试剂盒均购自南京建成生物技术有限公司;免疫球蛋白A(IgA)含量检测试剂盒购自美国Bethyl公司。 1.2 去蛋白凝胶的制备 取健康状况良好的21日龄爱拔益加(Arbor Acres,AA)肉仔鸡,处死后置75%酒精中消毒10min,打开腹腔,截取3~5cm空肠组织,置于磷酸盐缓冲液(PBS)中,彻底清除肠内容物,去除肠系膜、血管和结缔组织,纵向剪开肠道,用PBS冲洗空肠组织4~5次。将清洗干净的空肠组织转入干净的玻璃培养皿中,平面铺开,加入0.01%胶原酶-Ⅰ1mL,置5%CO237℃培养箱中消化30min。加入含有10%小牛血清的RPMI 1640培养液1mL终止消化。取5mL离心管加淋巴细胞分离液2mL,然后将收集的酶消化液缓缓加入淋巴分离液中,2 000r/min离心15min,收集淋巴细胞层。吸取淋巴细胞层转移至5mL离心管中,加入RPMI 1640培养液冲洗3遍,每次洗涤后均于1 500r/min离心15min。沉淀用RPMI 1640培养液重悬,台盼蓝染色后计数,调整细胞浓度至1×106个/mL,方法参照Yang等。 1.3 gln的终浓度 预先将Gln稀释成一定的浓度梯度(0、10、50、100、200μg/mL),然后将细胞悬液加入96孔培养板中,加入不同浓度的Gln 20μL,用RPMI1640完全培养液将每孔调整到200μL,则在此培养体系中Gln的终浓度分别为0、10、50、100、200μg/mL。置5%CO237℃培养箱中培养24h后,加入LPS(终浓度为15μg/mL),然后继续培养48h。培养结束前6h,每孔加入10μL MTT(初始浓度为5mg/mL),继续培养。培养结束后,每孔加入100μL 10%SDS-0.04mol/LHCl溶液,继续培养2h,使紫色结晶完全溶解,用酶联免疫检测仪在570nm波长下测定OD值。 1.4 肠道黏膜氧化应激 分离肉仔鸡肠道黏膜淋巴细胞,用0.3mmol/L双氧水(H2O2)刺激30min,模拟氧化应激环境,筛选肠道黏膜氧化应激的敏感指标。收集培养的细胞上清液,测定各种氧化应激指标和免疫应激指标。分光光度法检测SOD、GSH-Px和CAT活性及MDA含量,具体检测方法依据相应试剂盒进行。IgA含量的检测参照Bethyl试剂盒进行。 1.5 数据计数 试验数据采用Excel和SPSS 13.0软件ANOVA程序进行统计分析,Duncan氏法进行多重比较。 2 结果与分析 2.1 细胞培养及指导见表1 由图1可知,肉仔鸡肠道淋巴细胞分