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基于双向电泳图谱的菜青虫发育相关蛋白的生物信息学分析 蔡青是菜粉蝶科的一种蝴蝶。它是昆虫科的一种昆虫。根据以往的研究，蔡青的生长、发育、饲养和变形由体内的一些激素控制。它主要包括保护性激素、染色激素、促进前胸腺激素、抑制前胸腺神经蛋、调节侧体神经醇、促进吞咽侧体神经醇和转变壳激素。蛋白质组学方法不同于以往的特定蛋白质研究方法。这是一项科学研究及其生命变化规律。定量、动态、全球研究生物体，并接收相关细胞生理、生化过程和调节网络的信息。在后基因组时代的科学研究中，它是一种有效的研究方法，通过蛋白组学方法对入侵菜粉蝶生长发育的相关蛋白质进行了大规模过滤。与之前传统的固定特定蛋白质的研究方法不同。通过这种方法，可以发现新的检测青虫生长发育相关的蛋白质。目前，国内外还没有报道通过蛋白质组学方法对青虫蛋白质进行研究。本文的这项工作为构建菜粉蝶蛋白质组图，进一步阐明了歌青虫重要的生物学特征的形成机制，以及确定与发育相关的功能蛋白奠定了基础。 1 材料和方法 1.1 材料表面 采集于漳州龙海菜地的菜青虫五龄虫、预蛹及蛹. 1.2 实验方法 1.2.1 蛋白在提取和测定 丙酮沉降提取法:液氮研磨样品(加少量石英砂)至粉末,加至少4倍体积的丙酮-TCA样品处理液,-20 ℃沉淀过夜后离心,用含0.07 % β-巯基乙醇的丙酮洗涤沉淀,放置后离心,重复洗涤、放置、离心一次,抽真空干燥沉淀,30 mg干粉加1 mL裂解缓冲液,振荡1 h,超速离心1 h,取上清,Bradford法测定蛋白浓度,分装后-70 ℃冻存. 1.2.2 sds-东南角电泳 第一向采用自制等电聚焦胶条进行,使用pH范围在5～8和3.5～10的两性电解质载体,上样量700 μg,400 V,12 h后加电压到800 V.第二向为SDS,分离胶浓度12.5%,恒流10 mA,进入分离胶后加大到每板20 mA.待溴酚蓝跑到离胶底边缘1 cm处停止电泳,Neuhoff方法染色. 1.2.3 maldi-tof-ms检测maldi-tof-ms表达 扫描后用melanie 4软件分析,对图像进行光滑处理,背景消减,斑点检测,匹配等操作.以蛋白点的相对体积作为参考因素,相差两倍的点作为差异点.参考王京兰用标准蛋白建立PMF鉴定凝胶电泳分离蛋白质的方法以及人肺巨细胞癌细胞蛋白和白血病细胞HL-60的鉴定方法. 将蛋白点切下,用含50% CH3CN和50 mmol/L NH4HCO3的溶液洗胶和100% CH3CN脱水后,真空离心干燥,加入60～70 μL DTT,57 ℃恒温水浴1 h.去上清加入40 μL碘乙酰氨进行烷基化,避光1 h.吸出上清液,加入50% CH3CN和50 mmol/L NH4HCO3溶液反复吸涨,然后加入100% CH3CN脱水.再重复一次.胶粒真空离心干燥.加入2.5 μL胰蛋白酶液,0 ℃冰盒中放置30 min,待酶液完全被吸收,补充25 mmol/L NH4HCO35～8 μL,37 ℃保温6～15 h. 萃取后真空离心干燥,加入0.5% TFA 40% CH3CN溶液2 μL溶解,取1 μL溶解液与1 μL饱和基质混匀.用MALDI-TOF-MS进行分析,获得肽质量指纹图谱.通过搜索引擎Mascot,分别在NCBI和SwissProt数据库中进行检索,对照杂峰表对干扰峰进行去除,查询结果以分值表示.分值大于阈值(p0.05)时认为匹配结果可信,结合不同数据库的查询结果最终确定匹配结果. 2 结果 2.1 蛋白差异点的确定 菜青虫的五龄幼虫、预蛹、蛹这3种蛋白样品分别进行3次电泳,蛋白质的分布非常相似,大部分分布在pH4～10区间,分子量(Mr)在20～97 ku范围内.由于DTT作为蛋白还原剂使用,使得碱性端的条纹多于酸性端.虽然一定程度上影响了碱性端蛋白的分辨,但就目前来说,DTT仍然是较理想的,也是使用最普遍的还原剂.通过蛋白图谱分析软件分析结合人工观察,确定了18个差异点.对比3幅双向电泳图谱,五龄幼虫、预蛹和蛹的电泳图谱各有6个差异点表达量较高.部分差异点如图1所示. 考虑到样品的上样量、凝胶的染色、染色后的扫描以及对图像处理等许多因素的影响,所得到的凝胶图谱间不可能完全一致,即使相同表达量的蛋白在凝胶上也会有深浅的差异.而有些差异较小的点通过肉眼观察不能准确分辨.因此,需结合凝胶分析软件的分析结果判断差异点.我们目前使用的方法是通过比较两个点的相对体积(% vol),即该点转换成体积后的值与该图谱总的点的体积之和的比值.相对体积相差2倍以上的点经重复比较确认后确定为差异点.通过软件将点的vol(体积)值换算成相对值(% vol)可以更准确反映出该蛋白的表达量,消除了因上样量、染色或扫描的不一致引起的误差.目前的主流软件均将% vol作为评价蛋白差异