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Western-Blot之磷酸化蛋白之路

做磷酸化蛋白，磷酸酶抑制剂必不可少，若没有磷酸酶抑制剂，磷酸化蛋白很容易发生去磷酸化，轻者导致条带不明显，重者没有条带，从而导致实验重复性变差。下图就是加入磷酸酶抑制剂和不加磷酸酶抑制剂的区别（有图有真相，图1）。

图1.加入磷酸酶抑制剂和不加入磷酸酶抑制剂的条带区别

提蛋白一定全程要在4℃环境，尽量不要用超声波细胞破碎仪来粉碎细胞，低温高速离心机的转速不要超过14000rmp，时间不要超过10分钟，以5到8分钟为宜。得到的上清样品立即煮沸（最好用PCR仪煮沸）。所提取的蛋白样品一定要在两到三个星期之内全部做完。

凝胶电泳时，配置凝胶的试剂必须是两周之内新配制的，电泳缓冲液和转膜缓冲液必须现配现用，电泳时间不能超过2个小时。转膜完成后要用TBST缓冲液漂洗PVDF膜。

封闭液和抗体稀释液，最好选用3%或者5%的BSA溶液（具体浓度看抗体说明书）。不可以用牛奶去配制上述液体，因为牛奶里还有酪蛋白，可以促进蛋白质的去磷酸化，使磷酸化蛋白的条带变浅，甚至消失（用图说话，图2）。抗体尽量选用品牌抗体（Abcam，CST），一分钱一分货。

图2.BSA和脱脂奶粉封闭后的条带差别

Western跑磷酸化蛋白的要点

抗体

（1）并不是最贵的就是最好的，如果条件允许，建议同时购买不同厂家的抗体，一起来试一试，因为有时候即使是最好的品牌，不同批次稳定性也不一样。

（2）抗体从订购到到货有一定的时间，所以到货后请尽快分装好，准备做实验，我们当时因为实验进度问题，抗体到了3个多月才开始正式实验，这样拖了时间找厂家售后申诉也是很被动的。

（3）我们那时候用CST的一抗，感觉效果不稳定，也可能跟抗体放久了有关。最后买了另一家代理的抗体算是有了比较稳定的结果。当然，还是选择购买口碑较好的公司的产品为佳，这样即使出了问题售后也会跟进。如果经费有限，可以买买小包装的产品先试试，不少抗体公司还有5ul的抗体试用装免费申请。

（4）孵育一抗的时候，建议用新鲜抗体，什么意思呢？很多同学因为想图省事儿，很多时候配好孵育液，每次孵育好之后再次放进冰箱等待下次重复利用，一些比较好跑的蛋白到时没啥问题，但是磷酸化的蛋白建议每次都用新鲜的抗体原液，将条带剪下来后用杂交袋塑封好，按1：1000的比例加入抗体原液孵育，再这种情况下，100ul的抗体也是能用很久的，所以尽量每次都用新的抗体。

电泳

不同kb的蛋白电泳时间有所差别，参数啥的要用脑子更改，不能一成不变，避免发生那种蛋白跑不见了的惨剧。

洗膜

严格遵守洗膜时间，不得减少次数，每个步骤洗3次，每次可以洗长一点，比如（11-12分钟）。

蛋白上样

普遍反映磷酸化的条带很淡，有时候达不到制图标准，这点可以加大上样量来解决，另外，磷酸化蛋白一般与非磷酸化的蛋白一起跑一起制图，它本来就是要比非磷酸化的要淡一些，不要过分担心。

封闭

这个步骤非常重要，强推BSA封闭，不要用脱脂奶粉封闭，BSA封闭对磷酸化的抗体效果非常好，而且也不贵。另外，BSA封闭液倒是可以反复使用不至于向奶粉一样臭掉，用来孵育一般非磷酸化的抗体，效果同样棒棒哒！

再者，封闭时间可以延长，一般封闭2-3小时的情况下，可以封闭延时到4小时。