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温度对草鱼鳞片中-型-圆二色谱分析的影响

鱼类胶原蛋白结构分析

类固醇是饲料中最具特色的蛋白质。该提取物广泛应用于许多领域，如食品、保健品、生物材料等。由于疯牛病、口蹄疫等疾病的流行,以牛、猪等陆生动物皮为原料所得胶原蛋白的安全性被质疑,世界各国都将其目光转向水产品胶原蛋白的研究。近几年来国内外对水产品胶原蛋白的研究主要集中于海洋鱼体,对鱼鳞等副产物中胶原蛋白的提取和性质的研究国内外报道并不多见,且都局限于海洋鱼鱼鳞。关于淡水鱼鱼鳞胶原蛋白的研究,仅有Kimura等对鲤鱼鱼鳞的提取及肽链组成进行了研究,而对其他淡水鱼鱼鳞胶原蛋白的组成、结构及温度效应还未见研究报道。胶原蛋白分子特殊的结构和胶原纤维的超分子结构,使之成为研制生物功能材料的理想材料,但温度是影响作为生物材料的胶原蛋白的变性的一个关键因素。目前,用于研究蛋白质结构分析的常用方法有:傅里叶变换红外光谱、拉曼光谱、圆二色谱、X射线衍射、核磁共振技术、荧光和紫外光谱等。董瑞新等利用激光显微共聚焦拉曼光谱从分子水平研究了Sigma公司Ⅰ型胶原蛋白的温度特性,讨论了谱线强度随温度的变化关系。肖和兰等利用红外光谱研究了温度对乳鼠皮肤胶原蛋白结构的影响。Ikoma等利用圆二色谱研究了真鲷和尼罗罗非鱼鱼鳞胶原蛋白结构的温度效应。但不同的分析方法都有一定局限性,傅里叶变换红外光谱检测分子振动时产生的偶极矩变化,它对极性基团敏感;而拉曼光谱对分子的形态及极化度的变化较为敏感,因此适合于检测非极性基团;圆二色谱只能用来分析很窄范围内的澄清溶液,因此单一的表征往往不能全面系统地解析温度对胶原蛋白结构的影响。本文利用傅里叶变换红外光谱、拉曼光谱和圆二色谱等多种手段相结合,系统研究温度对草鱼鱼鳞胶原蛋白二级结构的影响,旨在为淡水鱼鱼鳞胶原蛋白制品的开发提供有力的理论依据。

1材料和方法

1.1实验材料

草鱼鱼鳞胶原蛋白,依Nagai等的方法提取和纯化。

1.2主要设备和试剂

1.2.1光谱、质谱和二色谱仪

Nexus傅里叶变换红外光谱仪:美国Nicolet公司,inVia激光拉曼光谱仪:英国Renishaw公司,JASCOJ-810圆二色谱仪:JASCO公司。

1.2.2蛋白质标准品

甲叉双丙烯酰胺:Fluka分装,小牛腱Ⅰ型胶原蛋白:Sigma公司,考马斯亮兰R-250:Sigma公司,次高分子量蛋白质标准品:上海伯奥生物科技有限公司,其他试剂均为分析纯。

1.3实验方法

1.3.1样品溶液的制备

采用SDS垂直电泳,7.5%的分离胶;5%的浓缩胶;电泳缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3,含0.1%SDS);样品缓冲液为0.05mol·L-1pH8.0Tris-HCL缓冲液(含2%SDS,5%β-ME、10%甘油和0.02%的溴酚兰);0.25%的考马斯亮兰R-250甲醇水染色液;酸甲醇水脱色液(7.5%的甲醇、5%的冰醋酸)。

取冷冻干燥样品5mg溶于10mL样品缓冲液,100℃加热5min,10000r·min-1离心5min后上样。采用直流恒压电源:浓缩胶电压为100V,分离胶电压为160V,电泳时间3～4h。

1.3.2红外光谱测试

取鱼鳞胶原蛋白冻干品(约2mg)与KBr压片,取出样品置于红外光谱仪的变温附件中。红外光谱仪为美国Nicolet公司的Nexus傅里叶红外光谱仪,扫描范围为400～4000cm-1,分辨率为4cm-1。采用仪器的变温附件和控温装置,扫描温度点为20,35,60,90,110℃,每个温度点保温20min,对前三个温度点扫描信号累加200次。

1.3.3不同激光温度对咸鱼胶原蛋白冻干品制备的影响

拉曼光谱仪采用英国Renishaw公司的inVia激光拉曼光谱仪,仪器分辨率1cm-1,激光光源为波长785nm、功率300mW的二极管激光器,取微量(约10mg)鱼鳞胶原蛋白冻干品置于控温台内,在20,35,60,90,110℃各个温度点保温10min。测量拉曼谱范围为600～1800cm-1,扫描50次,采集时间10s。

1.3.4温度点

准确称取一定量鱼鳞胶原蛋白冻干品,用0.01mol·L-1乙酸配成浓度为0.5mg·mL-1的蛋白溶液,将其注入1mm光径的石英池,采用JASCOJ-810(JASCO公司)圆二色谱仪对样品在190～250nm进行扫描,实验设定五个温度点20,35,60,80,90℃,利用恒温水浴附件对每个温度点保温10min,扫描速率为1