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环过程中任一点检测荧光PCR反应的建立：引物、探针的设计：探针Tm为68-70
环过程中任一点检测荧光PCR反应的建立：引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃，30bp,5’不
才发荧光精品--变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光
：对目标序列的高特异性-----性结果确定设计相对简单-----目标序列某一区域互补重复
确定：一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高
一、实时荧光定量PCR原理
（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理
1、常规PCR技术：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
2、实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析
3、如何对起始模板定量？
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.
4、几个概念：
（1）扩增曲线：
：对目标序列的高特异性-----性结果确定设计相对简单-----目标序列某一区域互补重复)**
：对目标序列的高特异性-----性结果确定设计相对简单-----目标序列某一区域互补重复
)**探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光**Taq酶有5′→3′外
度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，
定量不准MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物反应Buffer体系的优化反应温度
（2）荧光阈值：
（
（3）Ct值：
CT值的重现性：
二聚体、变异产物、多种产物。（三）优点及缺点优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲析：可以优化
二聚体、变异产物、多种产物。（三）优点及缺点优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便
；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲
析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物
线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。方法二：TaqMan--解型杂交探针**5′端标记有报
0
非理想的PCR反应：X=X(1+Ex)n
X：初始模板量
5、定量原理：
理想的PCR反应：X=X*2n
0
n：扩增反应的循环次数
X：第n次循环后的产物量
0
Ex：扩增效率
5、标准曲线
析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer
析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物
)**探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光**Taq酶有5′→3′外
能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400bp，引物Tm为59-60℃反应参数的
6、绝对定量
1）确定未知样品的C(t)值
2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
7、DNA的荧光标记：
循环后的产物量0Ex：扩增效率标准曲线精品--绝对定量1
循环后的产物量0Ex：扩增效率标准曲线精品--绝对定量1）确定未知样品的C(t)值2）通过标准曲线由
二聚体、变异产物、多种产物。（三）优点及缺点优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便
线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。方法二：TaqMan--解型杂交探针**5′端标记有报
告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等**3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q
二、实时荧光定量
二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍
方法一：SYBRGreen法
（一）工作原理
1、SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光
)**探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，
)**探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光**Taq酶有5′→3′外
定量不准MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物反应Buffer体系的优化反应温度
确定：一般为：94℃，10-20S60℃，30-6
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