核酸的理化性质研究方法.pptVIP

第十二章、核酸通论第1页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三第十四章核酸的物理化学性质一、核酸的水解二、核酸的酸碱性质三、核酸的紫外吸收四、核酸的变性、复性及杂交第十五章核酸的研究方法一、核酸的分离、纯化和定量测定二、核酸的超速离心三、核酸的凝胶电泳四、核酸的核苷酸序列测定五、DNA聚合酶链反应（PCR）第2页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三核酸的化学结构和作为高聚物决定其理化性质：核酸的糖苷键和磷酸二酯键：可被水解；磷酸基和碱基：酸碱性质；碱基：紫外吸收特性；双螺旋结构：变性和复性。第3页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三一、核酸的水解（一）酸水解糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解，产生嘌呤和嘧啶碱（二）碱水解RNA的磷酸酯键更易被碱水解（RNA的核糖上有2’-OH，在碱作用下形成磷酸三酯，极不稳定易水解，产生核苷2’，3’-环磷酸酯，继续水解产生2’-核苷酸和3’-核苷酸）第4页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三（三）酶水解专一水解核酸的磷酸二酯键的酶称为核酸酶(nuclease)。能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶）。第5页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三1、核酸酶的分类（1）按底物专一性分类：核糖核酸酶（ribonuclease,RNase）：作用于核糖核酸；脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease,DNase）：作用于脱氧核糖核酸；（2）按底物作用的方式分类：核酸外切酶（endonuclease）：从多核苷酸链的末端开始,逐个将核苷酸切下的酶；核酸内切酶(exonuclease)：从多核苷酸链的内部开始水解核酸的酶。第6页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三（3）按磷酸二酯键断裂的方式分类：一种是在3’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是5’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（1）；另一种是在5’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是3’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（2）。PPPNNN(1)(2)(1)(2)5’3’第7页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三2、核糖核酸酶类牛胰核糖核酸酶、核糖核酸酶T1、核糖核酸酶T2等；3、脱氧核糖核酸酶类牛胰脱氧核糖核酸酶、牛脾脱氧核糖核酸酶、限制性内切酶等。4、N－糖苷酶第8页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三核酸酶底物切点产物胰核糖核酸酶RNA内切核酸酶嘧啶3’端，留下3’－P3’嘧啶单核苷酸或3’-嘧啶核苷酸结尾的寡聚核苷酸蛇毒磷酸二酯酶RNA，DNA外切核酸酶3’端，留下3’－OH5’－单核苷酸牛脾磷酸二酯酶RNA，DNA外切核酸酶5’端，留下5’－OH3’－单核苷酸大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ单链DNA外切核酸酶5’端，留下5’－OH3’－单核苷酸及一个末尾二核苷酸大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ双链DNA外切核酸酶3’端，留下3’－OH5’－单核苷酸第9页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三第10页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三二、核酸的酸碱性质1、碱基的解离C的N3有一对未共用电子，可与质子结合；C的烯醇式羟基具有释放质子的能力；U的N3酸性解离的pK1’=9.5;T的N3酸性解离的pK1’=9.9;A的N1pK1’=4.15G的N7pK1’=3.2N1pK2’=9.6；N9pK3’=12.4第11页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三2、核苷的解离戊糖的存在增强了碱基的酸性解离：A的N1pK1’由4.15降为3.63；C的pK1’由4.6降为4.15；第12页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三3、核苷酸的解离HpK1’＝1.5第13页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三核苷酸有磷酸与碱基，为两性电介质；U的碱基碱性极弱，不能形成兼性离子；A,G,C中，pK1’：第一磷酸基-PO3H2的解离；pK2’：含氮环＝N+H-的解离；pK3’：第二磷酸基-PO3H-的解离；故其pI＝（pK1’+pK2’）／2DNA变性双链打开后，碱基即参与酸碱滴定。第14页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三三、核酸的紫外吸收Py和Pu有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸能吸收紫外光，最大吸收峰为260nm。不同核苷酸第15页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三A260＝εCL公式中，A260为光密度ε，为26