聚合酶链式反应扩增与扩增产物克隆.docxVIP

实验方案

第五部分PCR产物的凝胶回收

这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。

几个细节：

1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。

2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。

3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。

4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。

第六部分PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选

1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）

15ul体系

T-easy1ul

Ligase1ul

2xbuffer7.5ul

DNA5.5ul

4度，过夜。

2：连接产物的转化

1） -70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；

2） 连接产物15ul全部加入，至于冰上30分钟；

3） 42度，90秒钟；

4） 冰上2分钟；

5） 800ulLB培养基；

6） 280rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；

7） 8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100-150ul；

8） 涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）

先涂：X-gar35ul

IPTG25ul

后涂：混悬液

过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，此处自联率较低。

3：取白斑，划种于新板上

新板：先涂：X-gar35ul

IPTG25ul

然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。

针头挑白斑划2道于板上相应区域内。

37度，孵箱过夜。

4：联系测序公司送测序。一般一个克隆在35-45元。

这一部分的细节：

1：涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上;

2：不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。

聚合酶链式反应(PCR)扩增与扩增产物克隆

概述

PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94°C下解链；(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50C左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍(图4),这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。

一、PCR反应中的主要成份

引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16-30bp,太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2)引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm=4(G+C)+2(A+T).(3)四种碱基应随机分布，在3’端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。(4)引物3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5)在引物内，尤其在3’端应不存在二级结构。(6)两引物之间尤其在3’端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。(7)引物5’端对扩增特异性影响不大可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5’端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。(8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构，以免产生非特异性扩增,影响产量。(9)简并引物应选用简并程度低的密码子，例如选用只有一种密码子的Met,3’端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。

一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0Mmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。利用紫外分光光度计，可精确计算引物浓度，在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：

Xmol/L=OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)

X:引物摩尔浓度,A、C、G、T:引物中4种不同碱基个数。

4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用Na