酶的分离纯化.pptVIP

************************1.变性的本质蛋白质变性作用的实质仅仅破坏了形成与稳定蛋白质分子空间构象的次级键，导致蛋白质分子空间构象的改变或破坏，而不涉及一级结构的改变或肽键的断裂。第96页,共120页，2024年2月25日，星期天SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，各种蛋白质所带的净电荷、分子量大小和形状不同而有不同的迁移率。但为了消除净电荷对迁移率的影响，可采用聚丙烯酰胺浓度梯度电泳，利用孔径的不同引起的分子筛效应将蛋白质分开。也可在整个电泳体系中加入SDS（十二烷基硫酸钠sodiumdodecylsulfate），则电泳的迁移率主要依赖于分子量，这种方法称为SDS，分为连续的和不连续的两种。第97页,共120页，2024年2月25日，星期天（3）SDS－PAGE电泳检测分子量1、分离胶：10％、12％，主要起分子筛作用。2、压缩胶：相同。作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的扁盘，提高分离效果。3、在蛋白质样品加1%SDS和1%的巯基乙醇，100℃水浴3分钟，凝胶中加入SDS。4、点样：样品与溴酚蓝染料混合，15～18ul。5、电泳缓冲液：加SDS。6、电泳：开始电流为15mA，然后30mA电泳，当染料距底部1.5cm时，停止电泳。第98页,共120页，2024年2月25日，星期天连续系统SDSD：连续的电泳缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应迁移；不连续的SDS:不连续电泳体系中缓冲液的离子成分、pH值、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场泳动不仅有电荷效应、分子筛效应、还具有浓缩效应，因此分离的条带清晰度和分辨率均较前者好，分辨率较连续的高出2倍左右。第99页,共120页，2024年2月25日，星期天SDS－PAGE电泳检测分子量方法：处理样品样品1%SDS和1%的巯基乙醇100℃水浴3分钟制备压缩胶制备分离胶（10％、12％）加电泳缓冲液加SDS点样15～18ul电泳开始电流为15mA然后30mA电泳，当染料距底部1.5cm时，停止电泳。第100页,共120页，2024年2月25日，星期天考马斯亮蓝染色固定液：50%甲醇454毫升，46毫升的冰乙酸。染色液：R250，用固定液配置，染色1小时。脱色液：冰乙酸75毫升，甲醇50毫升，蒸馏水定容至1000毫升，脱色过夜。第101页,共120页，2024年2月25日，星期天第102页,共120页，2024年2月25日，星期天银染色法灵敏度高：比考马斯亮蓝灵敏100倍，有ng的蛋白质可显带。染色方法：烦琐，费时。胶固定染色显色褪色整个过程要带手套，防止污染。第103页,共120页，2024年2月25日，星期天（B）银染的染色结果第104页,共120页，2024年2月25日，星期天蛋白酶分子量的确定分子量的确定：相对迁移距离(Rf)＝蛋白质分子迁移距离cm溴酚蓝迁移的距离cmRf＝0.2～0.8最好，查标准曲线。最终确定分子量为32000Da。胶的保存方法：用玻璃纸封好，阴干。第105页,共120页，2024年2月25日，星期天（4）蛋白质的转膜技术1、PVDF－聚偏二氟乙烯。2、解除N端的封闭：低电流预跑空胶2～2.5小时，采用15mA1.5小时，30mA半小时。3、分离胶：12％，压缩胶同上。4、电泳：方法同上，但是迁移速度明显快，1.5小时跑完胶。第106页,共120页，2024年2月25日，星期天（5）转PVDF膜的方法PVDF甲醇3～5秒电泳缓冲液浸15分钟滤纸10层在电泳缓冲液中浸湿滤纸、胶、PVDF、滤纸置于电泳槽中加电泳缓冲液PVDF接正极，胶接负极恒压40伏电泳2小时50分钟，电流在55～56mA染色