霍乱弧菌检测.ppt

?挑取粪便，直接接种于碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第一板）。?第一管碱性蛋白胨水在３７℃增菌６－８小时，沾取菌膜下表层液体，划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第二板），同时吸取0.1～0.2ml表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。?第二管碱性蛋白胨水增菌１８小时后划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第三板）。分离培养要点（两管三板法）：第21页,共33页，2024年2月25日，星期天第22页,共33页，2024年2月25日，星期天?经典的鉴定步骤要求每个平板应挑取5个以上可疑菌落,转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面待分纯培养后,再进行O1、O139群血清玻片凝集试验，鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑,现大多数监测实验室一般采用将血清玻片凝集试验前置的做法,作为快速筛查的手段,直接对平板上生长的单个可疑菌落进行玻片凝集试验,出现明显凝集时可做初步报告,对平板上出现可疑凝集的菌株必须马上转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面,待纯培养物生长良好后再次进行玻片凝集试验加以确证。?庆大霉素平板和4号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。?TCBS（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐。（TCBS平板生长的菌落不能直挑取进行玻片凝集试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验）可疑菌落的挑取第23页,共33页，2024年2月25日，星期天4号平板第24页,共33页，2024年2月25日，星期天TCBS平板培养菌落形态（呈黄色）第25页,共33页，2024年2月25日，星期天染色镜检革兰染色阴性的短杆菌血清凝集试验：?分别使用O1群，O139群霍乱血清进行凝集试验，同时使用生理盐水进行对照凝集，以排除与生理盐水发生凝集的自凝菌。?生理盐水不凝集，O1群血清明显凝集的菌落，进一步使用稻叶型和小川型血清进行凝集试验，判定型别：稻叶型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落为稻叶型，小川型血清凝集而稻叶型血清不凝集的菌落为小川型，如稻叶型血清和小川型血清均出现凝集的时候，要注意鉴别是否为彦岛型，需进行试管凝集试验且两者的凝集效价均超过一半以上才能判定为彦岛型，因为某些小川型菌落自身会带有少量的C抗原而出现与稻叶型血清发生弱凝集，因此如小川型血清凝集较稻叶型血清凝集有明显优势时应维持小川型的判定。?生理盐水不凝集，O139群血清明显凝集的菌落，一般为O139群，但其与O22群及O155群甚至一些非霍乱弧菌会出现交叉凝集，由上级实验室进行进一步确认。结合菌落特征和菌体形态，作出初步报告。必须注意同一样品中O1、O139群霍乱弧菌可能同时存在，有必要对所有选出的菌株都进行凝集试验，以免遗漏。四、霍乱弧菌鉴定-玻片凝集第26页,共33页，2024年2月25日，星期天霍乱弧菌的血清学鉴定要点9cm平板，1划1，严禁1划2。纯培养做血清学鉴定。凝集，肉眼可见大颗粒。不要误判。血清学凝集同时做盐水凝集对照，自凝菌排除。血清学凝集覆盖O1与O139。霍乱弧菌鉴定，以血清学为主，血清学凝集阳性即可初步报告。区别于肠杆菌科细菌（生化报告）。第27页,共33页，2024年2月25日，星期天进一步实验氧化酶试验1％盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液粘丝试验0.5％去氧胆酸钠水溶液第28页,共33页，2024年2月25日，星期天进一步实验生化鉴定?生化鉴定管：发酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、产酸不产气能分解色氨酸赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（+）精氨酸双水解酶（-）霍乱弧菌生化鉴定管（11种生化,套装，环凯）；?生化鉴定条：梅里埃API20E鉴定条等?全自动生化检测仪检测：梅里埃VITEK2COMP全自动生化鉴定卡等进一步分型鉴定(省CDC进行)?噬菌体分型?PFGE脉冲场分型第29页,共33页，2024年2月25日，星期天快速检测试剂盒1荧光PCRO1群、O139群双色荧光检测试剂盒霍乱CTX毒力基因荧光检测试剂盒2胶体金技术第30页,共33页，2024年2月25日，星期天荧光PCR检测霍乱弧菌---初筛

第31页,共33页，2024年2月25日，星期天检验程序标本增菌培养碱性蛋白胨水分离培养（TC