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基因工程：指将一种或多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者人工合成的基因，按照人们的愿望进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。因此，供体、受体、载体是基因工程的三大要素。

基因工程：指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。

上游技术是指外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）；下游技术涉及含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养，以及外源基因表达产物的分离纯化过程。

第二章

用于核酸操作的工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、核酸修饰酶

核酸内切酶：在核酸水解酶中，为可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶，与核酸外切酶相对应。

II型限制性内切酶

主要特性：①限制修饰—单功能；②蛋白结构—同源二聚体；③辅助因子—Mg2+；④识别序列—旋转对称序列；⑤切割位点—识别序列内或附近特异性切割

基本特性：①识别双链DNA分子中4～8对碱基的特定序列②大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧③识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构

影响活性的因素：

①DNA样品的纯度（蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等）

措施：a.加大酶的用量，1μgDNA用10U酶；b.加大反应总体积；c.延长反应时间

②DNA分子构型:不同构型DNA进行酶切时条件不同；同一DNA分子上不同位置的识别序列，切割效率明显不同

③DNA样品的甲基化程度：请看PPT

④酶的缓冲液性质:高浓度的酶和甘油、低离子强度、极端pH值会使核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性

⑤酶的性质：a.酶的纯度b.酶切反应的温度和时间

DNA连接酶

基本性质:①修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键；②修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键（T4-连接黏性末端）③连接多个平头双链DNA分子（T4-连接平头末端）

DNA聚合酶

大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolI）

基本性质：①5’→3’的DNA聚合酶活性②5’→3’的核酸外切酶活性③3’→5’的核酸外切酶活性

基本用途：制备32P标记的探针（杂交探针的制备）

大肠杆菌DNA聚合酶I大片段Klenow：DNApolI经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端2/3的大肽段）

基本性质：①5’→3’的DNA聚合酶活性②3’→5’的核酸外切酶活性（5’→3’的核酸外切酶活性——无）

基本用途：①补平由核酸内切酶产生的3’粘性末端；②DNA片段的同位素末端标记

③cDNA第二链的合成；④双脱氧末端终止法测定DNA序列

T4噬菌体DNA聚合酶

基本特性：①5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性；②在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切；③在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；④在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位

基本用途：①切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端；②DNA片段的同位素末端标记；

TaqDNA聚合酶：①5’→3’聚合酶活性；②5’→3’外切酶活性③最适温度75～80℃，辅助因子Mg2+

依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）：

基本特性：①以RNA为模板聚合cDNA链；②双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链；

末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）

基本特性：来自小牛胸腺；不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs

核酸修饰酶

T4-多核苷酸激酶（T4-PNP）

基本特性：在DNA、RNA的5’–OH上加磷（用于探针的末端同位素标记）

碱性磷酸单酯酶——脱磷作用：使DNA或RNA的5’磷酸变为5’–OH末端

第三章

载体：基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，本质是DNA复制子。

质粒：生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。

质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中的现象。不相容性的质粒组成不相容性群

多克隆位点MCS：载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性内切酶的酶切位点的DNA片段

表达质粒载体：在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体

载体应具备的条件：

具有能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制

具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点

具有合适的筛选标记基因，用于筛选重组体DNA

载体的功能:

运送外源基因高效转入受体细胞

为外源基因提供复制能力或整合能力

为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

（一）质粒

质粒载体：复制必需区、选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点(多克隆位点)。

（1）质粒的基本特征：

质粒的自主复制性

两大复制类型：①严紧型复制控制的质粒1-3拷贝

②