实验中的样本制备.ppt

感谢大家观看第85页,共85页，2024年2月25日，星期天旋转离心柱技术的一次操作过程一般在10分钟到20分钟不等，比传统纯化方法的操作时间（几个小时）大大减少。旋转离心柱纯化的DNA产物的OD260/OD280一般在1.80-2.00之间；分离纯化效率在80%-100%之间。目前，旋转离心柱技术已广泛应用于细胞核DNA、细菌DNA、质粒DNA、细胞MRNA、胶上DNA或RNA等核酸的纯化第53页,共85页，2024年2月25日，星期天核酸载体的膜化是旋转离心柱技术工业化使用的重要基础。随着微量核酸分离纯化技术的出现，操作的简便性、稳定性和重复性一直是围绕核酸分离纯化技术应用的核心问题。为了推出简便、稳定和重复性好的旋转离心柱产品，旋转离心柱技术中的核酸载体先后用过玻璃珠和藻胶等各种材料，直至20世纪90年代初才最后确定为人工膜。第54页,共85页，2024年2月25日，星期天膜化后的旋转离心柱产品具有操作简便、稳定、储存方便、重复可靠等特点，成为核酸纯化市场的主导产品。第55页,共85页，2024年2月25日，星期天旋转离心柱技术的适用性很广，可用于全血、抗凝血、血清、脑脊液、分泌物、唾液、痰尿、粪便、软骨、动植物组织等各种样品的核酸提取。第56页,共85页，2024年2月25日，星期天（二）玻璃粉吸附法

DNA或RNA可特异地吸附于玻璃粉上，因此将玻璃粉悬液与临床标本混匀、离心、洗涤玻璃沉淀，即可从玻璃粉上获得纯化的核酸。第57页,共85页，2024年2月25日，星期天Yamada等为简化使用PCR检测病原体的核酸提取方法，使用玻璃粉悬液直接从人外周血单个核细胞（PBMC）和血浆中提取核酸，这样得到的核酸标本用于DNA和RNA的扩增检测，得到满意的结果。其提取方法分述如下：第58页,共85页，2024年2月25日，星期天1．从细胞提取核酸

试剂

1%SDS（含10mmol/LEDTA）

4mol/LNaCl

玻璃粉悬液

乙醇洗涤（50%乙醇，10mol/LTris,pH7.4,1mol/LEDTA,50mmol/LNaCl）第59页,共85页，2024年2月25日，星期天(2)操作步骤

人外周血单个核细胞（PBMC）（2×105）

加入50μl1%SDS（含10mmol/LEDTA）

加入150μl4mol/LNaCl及50μl玻璃粉悬液混匀，置冰浴5分钟

10000rpm离心1分钟，倾去上清液

第60页,共85页，2024年2月25日，星期天用300μl乙醇洗涤液洗沉淀物3次

加入100μl水

3分钟洗脱DNA，离心

上清液即为含纯化DNA的核酸标本第61页,共85页，2024年2月25日，星期天2．从血清（浆）中提取用于RNA检测的核酸

（1）试剂

6mol/LGuSCN

玻璃粉悬液

无水乙醇

第62页,共85页，2024年2月25日，星期天2）操作步骤

200μl血清（浆）

加入200μl6M异硫氰酸胍及20μl玻璃粉悬液

室温90分钟

10000rpm离心1分钟，弃上清液

沉淀用300μl乙醇洗2次

沉淀物中加入50μl反转录反应缓冲液，将RNA先转录为CDNA，再进行PCR上述核酸提取方法具有通用性，可用于任何其他病原微生物的核酸提取。第63页,共85页，2024年2月25日，星期天（三）二氧化硅（SE）或

硅藻吸附法

除了玻璃粉以外，SE和硅藻（单细胞藻类的化石细胞壁，D）颗粒也具有特异吸附核酸的特性。Chaotropic试剂硫酸氰胍兼具细胞裂解及核酸失活两种特性，因而在高浓度硫氰酸胍存在下，从细胞（包括细菌）或病毒颗粒中释放出的核酸万分可结合于SE或D颗粒上第64页,共85页，2024年2月25日，星期天BOOM等利用硫氰酸胍和SE和D颗粒的上述特性，成功地从血清、尿液以及细胞中纯化了DNA和RNA，可在不到1小时内完成12个不同临床标本的核酸提取工作，其有Y/SE和Y/D两种提取方案，Y/SE方案为使用SE以提取血液和尿液等体液中的核酸；Y/D方案为使用D颗粒以提取细胞中的核酸。第65页,共85页，2024年2月25日，星期天1、Y/SE方案

（1）试剂

裂解缓冲液L6：120gGUSCN溶于100ml0.1mol/LTris-HCl,PH6.4,然后加入0.2mol/LEDTA,PH8.0(用NaOH调节)溶液22ml及2.6gTritonX-100.

洗涤缓冲液L2:120GGUSCN溶于100mL0.1mol/LTris-HCl,pH6.4,为使GUSCN溶解加快,可在60~65℃水浴下搅拌